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La costante di spegnimento di Stern-Volmer è stata calcolata come 7,83 × 104 M−1 a 298,15 K. , suggerendo una forte capacità di estinzione della fluorescenza del trans-resveratrolo.Il test di spostamento dei marcatori del sito prevedeva il sottodominio IIA come sito di legame del trans-resveratrolo all'HSA.L'approccio di docking molecolare prevede i residui di amminoacidi coinvolti nella formazione della tasca di legame.Come confermato dai test di spostamento del marker del sito, sia il trans-resveratrolo che l'AFB1 si legano all'HSA nello stesso sito di legame, il sottodominio IIA.Lo studio esplora la capacità del trans-resveratrolo di spostare AFB1 dal complesso HSA-AFB1, influenzando così il comportamento tossicocinetico di AFB1 associato all'esposizione ad AFB1.Il resveratrolo appartiene a una classe di polifenoli chiamati stilbeni aventi scheletro C6-C2-C61 ed è uno stilbene naturale presente in ampie quantità nell'uva2.In natura, la forma Cis e trans del resveratrolo si trova prevalentemente dove la forma trans è biologicamente più stabile e attiva3.Il trans-resveratrolo è chimicamente 3, 5, 4-triidro-trans-stilbene, ottenuto per la prima volta nel 1939 dall'album Veratrum.È una fitoalessina prodotta in risposta allo stress o al danno meccanico di una pianta4.È identificato in circa 70 specie di piante e si trova prevalentemente nella buccia e nei semi dell'uva rossa5.Nella buccia dell'uva si trova una concentrazione di circa 50-100 μg/g di trans-resveratrolo.È noto che il trans-resveratrolo possiede numerose proprietà, tra cui antitumorale5, antiossidante6 e antinfiammatorio7.Sono state riportate anche le sue proprietà neuroprotettive, antimicrobiche e antimicotiche8,9.Anche l'effetto del resveratrolo dietetico sui cambiamenti indotti da AFB1 nel pollo da carne è stato valutato in precedenza10.La struttura chimica della molecola di trans-resveratrolo è mostrata in Fig. 1a.Struttura chimica di (a) trans-resveratrolo e (b) aflatossina B1.L'aflatossina B1 è un materiale pericoloso ed è considerata un potente epatocancerogeno e mutageno.Si ottiene da funghi, Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus e Aspergillus nomius.Tuttavia, è stata segnalata anche la produzione di AFB1 da altre specie di Emericella11,12.Le colture come cereali, arachidi e mais sono esposte a questi funghi produttori di micotossine, portando alla loro contaminazione con AFB113.La contaminazione da AFB1 è un problema comune nei paesi in via di sviluppo a causa della mancanza di infrastrutture e strutture adeguate.Contamina i mangimi agricoli e rappresenta un grave rischio per la salute degli animali e dell'uomo.L'aflatossicosi diventa una seria preoccupazione se collegata al virus dell'epatite B (HBV) e dell'epatite C (HCV).Generalmente, ≤ 20% della popolazione nei paesi in via di sviluppo è affetta da infezione da HBV e HCV.Tuttavia, quando si combinano infezione da HBV o HCV e aflatossicosi, la probabilità di sviluppare il cancro aumenta14.La dinamica di legame di AFB1 con HSA è già stata documentata e si lega moderatamente con una costante di legame di ~ 104 M−1.La struttura molecolare di AFB1 è illustrata in Fig. 1b.L'HSA è una delle principali proteine ​​di trasporto nell'uomo, con un peso molecolare di 66,5 kDa comprendente 585 residui di amminoacidi, con un singolo triptofano cioè Trp-21415.La presenza di residui di amminoacidi aromatici come Trp, Tyr e Phe conferisce all'HSA la sua proprietà fluorescente.Tuttavia, il contributo significativo è dovuto ai residui di triptofano.È una proteina modello che è stata esplorata per studiare le interazioni ligando-proteina.Gli studi di farmacocinetica e farmacodinamica di molecole che utilizzano strumenti biofisici sono prerequisiti per determinarne l'efficacia, la tossicità e il processo di eliminazione dall'organismo.Esistono numerosi studi che esplorano la tossicità epatocellulare di AFB1 utilizzando approcci in vitro e in vivo.Tuttavia, gli studi che mirano al destino di questo epato-cancerogeno in presenza di albumina sierica e viceversa sono meno numerosi.Recentemente pochi studi si sono concentrati sul comportamento di legame di AFB1 con BSA, HSA e albumina d'uovo di gallina16,17,18, hanno fornito informazioni sulla sua costante di legame, sito di legame e parametri termodinamici.Tuttavia, questi studi hanno delle lacune che devono essere colmate da un approccio che potrebbe scaricare la micotossina dalla precisa posizione di legame nell'albumina sierica, portando alla sua biotrasformazione seguita dalla sua eliminazione dal corpo.Questo studio si concentra sullo stesso approccio utilizzando un polifenolo trans-resveratrolo che potrebbe rimuovere efficacemente l'AFB1 dall'albumina sierica utilizzando strumenti spettroscopici a fluorescenza.Nel presente studio, la spettroscopia di assorbimento UV viene utilizzata per studiare le alterazioni strutturali e la formazione di complessi allo stato fondamentale tra HSA e trans-resveratrolo, la spettroscopia di fluorescenza è stata utilizzata per calcolare la costante di legame del polifenolo e HSA, parametri termodinamici (ΔG, ΔH e ΔS), seguito dal test di spostamento del marker del sito per esaminare il sito di legame del trans-resveratrolo sull'HSA.Lo studio del dicroismo circolare è stato condotto per studiare i cambiamenti della struttura secondaria indotti dal trans-resveratrolo in HSA, seguiti dal calcolo della temperatura di fusione (Tm).Sono stati anche determinati la denaturazione termica dipendente dalla temperatura e il profilo di dispiegamento dell'HSA in presenza di trans-resveratrolo.L'analisi dell'aggancio molecolare ha visualizzato i residui di amminoacidi coinvolti nel legame del trans-resveratrolo con l'HSA insieme alle principali forze di legame che stabilizzano le entità interagenti.In silico è stato condotto uno studio di sostituzione dell'amminoacido per accertare il ruolo di Trp-214 nel processo di legame del ligando alla molecola proteica.Dopo aver confermato la posizione di legame del polifenolo, è stata stabilita un'analisi comparativa della forza di spegnimento della fluorescenza del trans-resveratrolo rispetto a AFB1 per HSA.Successivamente, sono stati eseguiti i saggi di spostamento per analizzare il potenziale di rimozione del trans-resveratrolo per spostare l'AFB1 dall'HSA e viceversa.Il risultato di questo studio aiuterà i ricercatori a comprendere la cinetica e la dinamica del processo di legame del trans-resveratrolo e dell'AFB1.La modalità di legame e interattiva del trans-resveratrolo flavonoide con HSA è stata studiata prima del suo utilizzo come agente di distacco per AFB1 legato all'HSA.Il comportamento di legame è stato studiato utilizzando strumenti spettroscopici come la spettroscopia di fluorescenza e la spettroscopia UV-visibile.La spettroscopia di assorbimento UV è stata utilizzata per accertare i cambiamenti strutturali indotti dal trans-resveratrolo in seguito al legame con l'HSA.La proprietà di assorbimento UV dell'HSA è in virtù dei suoi amminoacidi aromatici (Trp, Tyr e Phe) che impartiscono un forte segnale di assorbimento UV a 280 nm19.Tuttavia, il trans-resveratrolo mostra il segnale di assorbimento a 319 nm, come mostrato in Fig. 2a.Dalla Fig. 2a, è chiaro che in presenza di una concentrazione crescente di trans-resveratrolo, l'effetto ipercromico è stato osservato ai massimi di assorbimento (λmax) di HSA, accoppiato con spostamento batocromico, suggerendo alterazioni strutturali nella struttura nativa di HSA e una formazione di complessi dello stato fondamentale tra trans-resveratrolo e HSA20.Lo spettro di assorbimento fornisce anche un indizio sull'esistenza di un quenching statico tra trans-resveratrolo e HSA, poiché nel tipo statico di quenching, gli spettri di assorbimento della proteina nativa cambiano in presenza di una molecola di ligando, tuttavia nel quenching dinamico rimane inalterato21 ,22.La spettroscopia di fluorescenza è stata eseguita per ottenere informazioni dettagliate sui parametri di legame e termodinamici associati all'interazione del trans-resveratrolo con l'HSA.Quando eccitato a 280 nm, è stato osservato un forte spegnimento della fluorescenza nello spettro di emissione di fluorescenza dell'HSA in presenza di una concentrazione crescente di trans-resveratrolo (0–14 µM) come mostrato in Fig. 2b.L'HSA è costituito da fluorofori, fondamentali per la proprietà fluorescente della proteina, vale a dire Trp, Tyr e Phe, dove il contributo principale proviene dal residuo di Trp-21423.L'estinzione è accompagnata da spostamento verso il rosso che suggerisce alterazioni strutturali e conformazionali nella struttura nativa dell'HSA in presenza di trans-resveratrolo.Lo spostamento batocromico è il risultato dell'aumento della polarità attorno ai fluorofori in HSA in presenza di trans-resveratrolo24.(a) spettro di assorbimento UV di HSA (5 µM) e (b) spettro di emissione di fluorescenza di HSA (5 µM) in presenza di una concentrazione crescente di trans-resveratrolo (0–14 µM) a 298,15 K e pH 7,4 .λex di HSA = 280 nm.La concentrazione di trans-resveratrolo da solo è 2 µM.La costante di spegnimento di Stern-Volmer (KSV) per il legame del trans-resveratrolo con HSA è stata calcolata secondo l'Eq.(1) 25. C'è linearità tra la concentrazione di T-res (Q) e F0/F, come mostrato in Fig. 3a, a 298,15, 303,15 e 308,15 K. Con l'aumento della temperatura, una diminuzione della pendenza della trama di Stern-Volmer, il legame tra HSA e trans-resveratrolo si destabilizza anche con l'aumento della temperatura, suggerendo una modalità statica di spegnimento della fluorescenza e annullando l'esistenza di un meccanismo di spegnimento dinamico che opera tra HSA e trans-resveratrolo26.Tuttavia, dalla Fig. 3a, se osserviamo il grafico F0/F vs Q a 298,15 K, a una maggiore concentrazione di trans-resveratrolo, il grafico F0/F vs Q viene spostato verso l'asse y, prevedendo un tipo misto di fluorescenza meccanismo di spegnimento a 298,15 K, tuttavia, il grafico mostra la retta completa a 303,15 e 308,15 K. Il contributo principale è per la natura statica dello spegnimento della fluorescenza poiché il valore KSV diminuisce con l'aumento della temperatura È stata effettuata un'ulteriore conferma del meccanismo di spegnimento statico calcolando la costante di spegnimento bimolecolare (Kq) utilizzando l'Eq.(3)25 della sezione “Metodi”.Il valore numerico di Kq ottenuto a tre diverse temperature, come mostrato in Tabella 1, è maggiore della massima costante di collisione di scattering il cui valore è 2 × 1010 M−1 s−1, confermando così l'esistenza del quenching statico e del complesso dello stato fondamentale formazione tra HSA e trans-resveratrolo24,27.In un'interazione proteina e ligando, è possibile osservare tre diverse nature di estinzione della fluorescenza, estinzione statica, dinamica e mista (sia statica che dinamica).Questi diversi tipi di modelli di tempra possono essere differenziati in base ai valori KSV ottenuti a diverse temperature.L'estinzione statica è caratterizzata dalla formazione di complessi allo stato fondamentale tra la molecola del ligando e la proteina28, seguita da una diminuzione dei valori di KSV con un aumento della temperatura.La diminuzione del KSV è il risultato di una diminuzione del ligando e della stabilità proteica con l'aumento della temperatura.Tuttavia, nella natura dinamica dell'estinzione della fluorescenza, il valore KSV aumenta con l'aumento della temperatura29,30.L'estinzione dinamica risulta dalla collisione del fluoroforo e della molecola del ligando.La natura mista dell'estinzione della fluorescenza mostra sia le proprietà dell'estinzione statica che quella dinamica31.(a) Grafico di F0/F rispetto a Q per il calcolo della costante di spegnimento di Stern–Volmer (KSV), (b) Grafico di log (F0/F)/F rispetto a log (Q) per il calcolo della costante di legame (Kb) , (c) Grafico di Van't Hoff di lnK rispetto a 1/T (K) per il calcolo dei parametri termodinamici per il sistema HSA-T-res, a 298,15, 303,15 e 308,15 K e pH 7,4.La costante di legame (Kb) è stata calcolata a tre diverse temperature, vale a dire 298,15, 303,15 e 308,15 K utilizzando l'Eq.(4)25,32, citato nella sezione “Metodi”.Il grafico di log (F0 - F)/F rispetto a log (Q) è mostrato in Fig. 3b.Il grafico è una linea retta e il valore di Kb è stato calcolato in 6,36 ± 0,32 × 107 M-1 a 298,15 K. Una costante di legame così elevata è un'indicazione di una forte affinità di legame tra HSA e trans-resveratrolo.I valori di Kb e il numero di siti di legame (n) a tre diverse temperature sono riportati in Tabella 2.L'affinità di legame di AFB1 verso HSA è già stata riportata in precedenza da Tan et al.33.AFB1 si lega a HSA nel sottodominio IIA con una costante di legame ~ 104 M−1.La costante di legame (Kb) per il sistema AFB1-HSA è inferiore al sistema HSA-T-res.L'energia libera di Gibbs (ΔG), la variazione di entalpia (ΔH) e la variazione di entropia (ΔS) sono i parametri termodinamici essenziali che descrivono la spontaneità e la preferenza di una reazione chimica.Questi valori termodinamici sono calcolati utilizzando le Eq.(6) e (7) della sezione “Metodi”.La Figura 3c mostra il grafico lnK rispetto a 1/T (K), l'intercetta e la pendenza del grafico sono state utilizzate nel calcolo di ΔS e ΔH, che è stato calcolato essere −257,67 cal mol−1 K–1 e −87,60 kcal mol -1, rispettivamente.L'entità di ΔS e ΔH è negativa, a significare il legame idrogeno e l'interazione di van der Waals come le principali forze che agiscono nell'HSA e nella stabilizzazione del complesso trans-resveratrolo.Le principali forze che agiscono tra la proteina e la molecola del ligando sono il legame idrogeno e l'interazione di van der Waals quando ΔS < 0 > ΔH34.Abbiamo anche calcolato il valore di ΔG per il sistema HSA-T-res che è risultato negativo, suggerendo un processo favorevole e spontaneo di legame trans-resveratrolo con HSA.Tutti i parametri termodinamici sono riportati in Tabella 2.La nostra molecola di interesse, il trans-resveratrolo, si lega all'HSA con un'affinità molto più elevata rispetto all'AFB1, possedendo quindi il potenziale per competere con l'AFB1.Abbiamo ulteriormente esplorato il sito di legame del trans-resveratrolo su HSA utilizzando marcatori del sito, warfarin e ibuprofene.Questi due marker di sito sono molecole sonda usate di routine per localizzare il sito di legame di una piccola molecola sulla proteina35.La maggior parte del ligando si lega alla proteina nel sito I di Sudlow (sottodominio IIA) e nel sito 2 di Sudlow (sottodominio IIIA).Il warfarin si lega al sottodominio IIA e l'ibuprofene al sottodominio IIIA.La posizione di legame di AFB1 su HSA è già stata studiata da Tan et al.e Poor et al.17,33, confermando il sito 1 di Sudlow come la tasca vincolante di AFB1 su HSA.Se trans-resveratrolo e AFB1 condividono lo stesso sito di legame sulla molecola proteica, il trans-resveratrolo, in virtù della sua maggiore costante di legame (Kb) per HSA rispetto a AFB1, potrebbe facilmente spostare la micotossina dall'HSA e aumentarne la disponibilità nell'organismo in forma libera anziché vincolata.Lo spostamento percentuale è stato calcolato dal grafico di F2/F1 × 100 rispetto alla sonda/HSA, ottenuto utilizzando l'Eq.(7) della sezione “Metodi”36,37.Dalla Fig. 4, si deduce che la percentuale di spostamento del trans-resveratrolo da parte del warfarin è più evidente dell'ibuprofene, il che fornisce un indizio sul fatto che il trans-resveratrolo si lega nel sito dell'HSA in cui si lega il warfarin, suggerendo il sottodominio IIA o il sito 1 di Sudlow come il sito di legame del trans-resveratrolo in HSA.Vari studi sulle interazioni tra ligando e proteine ​​hanno utilizzato saggi di spostamento dei marker di sito come metodo affidabile per individuare il sito di legame del ligando di interesse nelle molecole proteiche38,39.Rappresentazione grafica del test di spostamento del marcatore del sito per la posizione del sito di legame del trans-resveratrolo su HSA a 298,15 K e pH7,4, i marcatori del sito di warfarin e ibuprofene sono stati utilizzati rispettivamente per il legame specifico del sottodominio IIA e del sottodominio IIIA.Al livello di 0,05 (p < 0,05), i dati sono significativi.La barra di errore rappresenta il valore della deviazione standard (media ± SD).Il dicroismo circolare è uno strumento prezioso per decifrare il cambiamento conformazionale o di struttura secondaria nella proteina indotta da un ligando40.Si tratta di una tecnica usata di routine coinvolta nell'interazione tra ligando e proteine ​​per studiare la natura del legame tra proteine ​​e molecole41.L'interazione dei cromofori nella molecola proteica, in un ambiente asimmetrico, con la luce polarizzata si traduce in segnali CD42.I legami peptidici assorbono la luce polarizzata nella lontana regione UV43.Il segnale UV-CD lontano di HSA con alfa elica predominante mostra due ellitticità negative a 208 e 222 nm come conseguenza della transizione n → π* e π → π*44.Dalla Fig. 5a, si osserva che l'HSA nativo mostrava due picchi a 208 e 222 nm, suggerendo la predominanza dell'alfa elica.Il valore MRE a 208 nm e l'alfa elica percentuale è stato calcolato utilizzando le eq.(8) e (9) del paragrafo “Metodi”38,45.(a) Spettri UV-CD lontani di HSA (5 µM) in presenza di una diversa concentrazione di trans-resveratrolo con HSA (10 µM e 20 µM) a 298,15 K e pH 7,4.(b) Grafico a barre che mostra i valori CD in mdeg, a 280 e 222 nm, per HSA da solo e HSA in presenza di diverso rapporto molare del trans-resveratrolo (1:2 e 1:4).L'HSA nativo ha mostrato un contenuto alfa-elicoidale del 61,39%.In presenza di trans-resveratrolo (10 e 20 µM), il contenuto alfa-elicoidale è stato modificato rispettivamente in 65,07 e 68,24%.Le figure 5a, b indicano i cambiamenti conformazionali indotti dal trans-resveratrolo e l'aumento dell'alfa-elica nell'HSA, suggerendo la stabilizzazione della struttura nativa dell'HSA in presenza di trans-resveratrolo.Concentrazioni inferiori di trans-resveratrolo (2–8 µM) hanno indotto cambiamenti insignificanti nella struttura secondaria dell'HSA.La Figura 5b mostra i valori CD a 208 e 222 nm per HSA in assenza e presenza di trans-resveratrolo, che illustra un quadro chiaro dell'aumento dei valori CD (mdeg) corrispondenti all'aumento di un'alfa elica a 10 e 20 µM trans -resveratrolo.Alcuni fitochimici e molecole di farmaci, nell'interazione con le albumine, hanno dimostrato di aumentare l'alfa elica e quindi la sua stabilità, ed è dovuto ad un aumento del grado di legame idrogeno nelle molecole proteiche46,47,48.La stabilità termica dell'HSA in presenza di trans-resveratrolo è stata anche studiata mediante spettroscopia CD, misurando le variazioni del segnale CD a 222 nm mediante raccordo sigmoidale, in funzione della temperatura (20–90 ° C).Le interazioni idrofobiche sono i principali contributori al meccanismo di ripiegamento delle proteine.Tuttavia, anche altri fattori come il legame idrogeno e le interazioni elettrostatiche svolgono un ruolo significativo nella stabilizzazione della struttura proteica49.Tm è la temperatura di transizione del punto medio a cui viene mantenuto l'equilibrio tra la forma piegata e quella spiegata50.La stabilità termica della proteina è direttamente proporzionale al suo valore Tm.In altre parole maggiore è il valore Tm maggiore è la stabilità termica della proteina51.L'HSA nativo ha mostrato valori di Tm di 63,75 ° C.Tuttavia, in presenza di trans-resveratrolo, è stato aumentato a 66,25 °C.L'aumento del valore Tm da 63,75 ° C a 66,25 ° C conferma il ripiegamento trans-resveratrolo-assistito di HSA.L'esperimento di dispiegamento termico esplora ulteriormente che la stabilità termica dell'HSA è aumentata in presenza di trans-resveratrolo.È noto che alcuni farmaci che si legano al sottodominio IIA, come il warfarin e la virstatina, aumentano la Tm di HSA, come riportato in studi precedenti52,53.La Figura 6 mostra il profilo di fusione dell'HSA in presenza di trans-resveratrolo.Profilo di fusione termica dell'HSA (5 µM), in presenza di trans-resveratrolo (20 µM) per il calcolo della Tm nell'intervallo di temperatura da 20 °C a 90 °C e pH 7,4.Sono stati anche tracciati spettri CD tridimensionali di HSA lontani UV- in assenza e presenza di trans-resveratrolo in funzione della temperatura per prevedere la perturbazione strutturale e conformazionale indotta dal ligando di HSA a ciascuna temperatura compresa tra 20 e 90 ° C.Dalla Fig. 7, è chiaro che ad ogni aumento della temperatura da 20 a 90 °C, l'ellitticità negativa a 208 e 222 nm diminuisce, suggerendo il dispiegamento dell'HSA in funzione della temperatura.In presenza di 20 µM di trans-resveratrolo, il contenuto alfa-elicoidale dell'HSA è protetto ad ogni aumento della temperatura, suggerendo la stabilizzazione mediata dal trans-resveratrolo della struttura secondaria dell'HSA nativo.Dalla tabella 3, è evidente che a 20 ° C, l'HSA nativo mostrava il 61,30% di alfa-elica e a 90 °C era ridotto al 27,69% a causa del dispiegamento e della denaturazione indotta dalla temperatura.Tuttavia, l'HSA legato al trans-resveratrolo a 20 ° C mostrava il 67,58%, superiore al solo HSA, ad ogni incremento della temperatura;Il trans-resveratrolo legato all'HSA ha mostrato un'alfa-elica più elevata rispetto al solo HSA alla stessa temperatura.La drastica diminuzione dell'alfa elica in HSA in funzione della temperatura è attribuita alla riduzione del legame idrogeno negli amminoacidi.Tuttavia, il trans-resveratrolo si è dimostrato efficace nel proteggere lo sviluppo dell'HSA, ripristinando così il legame idrogeno nei residui di amminoacidi a un determinato intervallo di temperatura.La Figura 7 riflette gli spettri UV-CD lontani di HSA in presenza di trans-resveratrolo da 20 a 90 ° C.Spettri CD lontano UV di (a) HSA da solo, (b) HSA in presenza di trans-resveratrolo (20 µM) in funzione della temperatura compresa tra 20 e 90 ° C.Spettri CD tridimensionali a raggi UV lontani di (c) HSA da solo e (d) HSA in presenza di trans-resveratrolo (20 µM) in funzione della temperatura compresa tra 20 e 90 ° C.Dopo aver confermato che AFB1 e trans-resveratrolo condividono lo stesso sito di legame, sottodominio IIA in HSA, è stato seguito il test di spostamento per verificare il potenziale di rimozione del trans-resveratrolo contro AFB1 in competizione per la stessa tasca di legame.In Fig. 8a, è mostrato che ogni concentrazione crescente di trans-resveratrolo (0–20 µM), sposta l'AFB1 legato all'HSA dal sistema HSA-AFB1.Tuttavia, quando è stato studiato il potenziale di spostamento di AFB1 contro il trans-resveratrolo per il sistema HSA-Tres, come mostrato in Fig. 8b, AFB1 non è riuscito a rimuovere il trans-resveratrolo dall'HSA, indicando l'incapacità di AFB1 di competere per la condivisione dell'albumina lo stesso sito di legame con il trans-resveratrolo.Dalla Fig. 8b, è chiaro che l'aumento della concentrazione di AFB1 (0–20 µM) non ha alcun effetto sullo spostamento percentuale del trans-resveratrolo legato all'HSA.Rappresentazione grafica di (a) spostamento di AFB1 da parte del trans-resveratrolo nel sistema HSA-AFB1, (b) spostamento del trans-resveratrolo da parte di AFB1 nel sistema HSA-T-res.Al livello di 0,05 (p < 0,05), i dati sono significativi.La barra di errore rappresenta il valore della deviazione standard (media ± SD).Abbiamo anche eseguito l'analisi comparativa dell'effetto di AFB1 e trans-resveratrolo su HSA, come illustrato in Fig. 9. Dalla figura, in base ai valori delle intensità di fluorescenza, lo spettro di emissione di HSA ha subito un maggiore spegnimento in presenza di trans-resveratrolo rispetto a AFB1.La diminuzione dell'intensità della fluorescenza è maggiore in HSA + T-res rispetto a HSA + AFB1.Per ottenere ulteriori informazioni sul potenziale di rimozione del trans-resveratrolo, in competizione per l'HSA, sono state utilizzate concentrazioni uguali di AFB1 e trans-resveratrolo per spostare rispettivamente l'HSA legato al trans-resveratrolo e l'HSA legato ad AFB1.Dalla tabella 4, è evidente che l'HSA da solo (5 µM) ha mostrato un'intensità di fluorescenza di 47.776,6, l'intensità di fluorescenza in presenza di AFB1 e trans-resveratrolo è stata ridotta rispettivamente a 37.322,6 e 24.784,8.L'intensità di fluorescenza di HSA per il sistema HSA + T-res + AFB1 (Tabella 4) differiva in modo insignificante dall'intensità di fluorescenza del sistema HSA + T-res, confermando così l'incapacità di AFB1 di spostare il trans-resveratrolo da HSA-T- ris.Tuttavia, l'intensità di emissione di fluorescenza dell'HSA per il sistema HSA + AFB1 + T-res (Tabella 4) è cambiata significativamente dall'intensità di emissione di fluorescenza del sistema HSA + AFB1, chiarendo la potenzialità del trans-resveratrolo di rimuovere l'AFB1 legato all'albumina e catturando il suo sito di legame.Rappresentazione grafica dell'intensità di fluorescenza di HSA in presenza di trans-resveratrolo e AFB1, eccitato a 280 nm.La concentrazione di HSA è 5 µM e la concentrazione di T-res = AFB1 = 14 µM.Al livello di 0,05 (p < 0,05), i dati sono significativi.La barra di errore rappresenta il valore della deviazione standard (media ± SD).L'aggancio molecolare è un potente approccio computazionale per studiare il legame del ligando alla molecola proteica a livello atomico54.Questi strumenti in silico sono stati utilizzati per esplorare e riconoscere il sito di legame del trans-resveratrolo nell'HSA, corroborare i risultati degli studi spettroscopici e ottenere informazioni sui residui di amminoacidi coinvolti nel legame del trans-resveratrolo con l'HSA.La Figura 10 mostra la posa meglio agganciata e il sito 1 di Sudlow come tasca di rilegatura per il legame del trans-resveratrolo con HSA.L'energia di legame per l'interazione calcolata dall'aggancio è −7,76 kcal mol−1.Se osserviamo la Fig. 10, Trp-214 è presente nella tasca di legame e ha un ruolo nella stabilizzazione del complesso trans-resveratrolo HSA.I residui di amminoacidi che circondano la molecola di trans-resveratrolo sono mostrati nella Tabella 5. La Figura 11 mostra l'immagine 2D dei residui di amminoacidi in prossimità del trans-resveratrolo e la natura dei legami formati tra di loro.Il legame idrogeno e le interazioni di van der Waals sono meglio illustrati dal pot 2D dell'HSA e dall'interazione trans-resveratrolo.Precedenti studi sull'interazione di AFB1 con HSA hanno anche confermato il sito 1 di Sudlow come tasca di legame per AFB1 utilizzando l'approccio in silico17, e i residui di amminoacidi coinvolti nel legame sono molto vicini a quelli coinvolti nell'HSA e nel legame trans-resveratrolo in lo stesso sito di Sudlow 1. Il van der Waals + legame idrogeno + energia di desolvatazione per HSA e complesso trans-resveratrolo era -9,07 kcal/mol, molto più alto della loro energia elettrostatica di -0,19 kcal/mol, proponendo così legame idrogeno e van der Interazione di Waals come le principali forze che stabilizzano l'HSA e il complesso trans-resveratrolo.Ciò conferma ulteriormente le nostre scoperte termodinamiche.Poiché l'affinità di legame del trans-resveratrolo è molto più alta dell'AFB1, il trans-resveratrolo è in grado di spostare l'AFB1 legato all'HSA per competere con il sito di legame.Siti di legame simili (sottodominio IIA) sono stati riportati anche in uno studio sul legame dell'ossiresveratrolo all'HSA39.Docking molecolare del trans-resveratrolo con HSA che mostra la migliore posa ancorata, il sito di legame e i residui di amminoacidi coinvolti nella stabilizzazione complessa.Rappresentazione bidimensionale dei residui di amminoacidi che si legano alla molecola del trans-resveratrolo.Abbiamo ulteriormente esplorato il legame dell'HSA mutato con il trans-resveratrolo.Nell'HSA mutato, il Trp-214 è stato sostituito con l'amminoacido neutro glicina per chiarire i cambiamenti nella modalità di legame del trans-resveratrolo con l'HSA mutante rispetto all'HSA non mutato.La glicina è stata sostituita al posto del Trp-214 perché anche la glicina, l'amminoacido più semplice, è neutra.Lo studio di docking molecolare ha rivelato che il complesso di trans-resveratrolo con HSA mutante era meno stabilizzato rispetto al complesso non mutato perché l'energia di legame del complesso HSA mutato era meno negativa rispetto al complesso non mutato.L'energia di legame del complesso e dei residui di amminoacidi coinvolti nella stabilizzazione del complesso HSA-trans-resveratrolo mutato è mostrata nella Tabella 5. È interessante notare che il sito di legame del trans-resveratrolo era situato nello stesso sottodominio IIA di come era con HSA non mutato.Tuttavia, il numero di legami idrogeno è stato ridotto solo a 2, come mostrato in Fig. 12. Gly-214 non è stato coinvolto in alcun tipo di legame con il trans-resveratrolo.È stato anche eseguito uno studio di mutazione sostituendo l'amminoacido idrofobo valina in Trp-214.Sorprendentemente, il sito di legame del trans-resveratrolo sull'HSA era diverso rispetto all'HSA nativo non mutato e l'HSA con Trp-214 sostituito con Gly.Anche l'energia di legame del complesso era meno negativa.Lo studio con HSA mutato è stato significativo poiché indaga il ruolo di Trp-214 durante la formazione del complesso stabilizzato tra HSA e trans-resveratrolo.La sostituzione di Trp-214 con Gly o Val non ha comportato la formazione di complessi altamente stabilizzati rispetto all'HSA non mutato.Il legame del complesso HSA mutato con il trans-resveratrolo era meno negativo rispetto all'HSA nativo.I residui di amminoacidi che formano la tasca di legame per l'interazione tra HSA mutante e trans-resveratrolo sono mostrati nella Tabella 5. La figura 12 mostra la posa meglio ancorata del legame del trans-resveratrolo con HSA mutato.La tabella 5 rappresenta i residui di amminoacidi coinvolti e le energie di legame nella formazione del complesso mutato HSA-trans-resveratrolo.Analisi di docking molecolare per il legame dell'HSA mutante Trp-214 al trans-resveratrolo.(a) Trp-214 è sostituito con residuo di glicina.(b) Trp-214 è sostituito con residuo di valina.Sono stati condotti studi di simulazione di dinamica molecolare (MD) per ottenere informazioni sulla natura dinamica del legame del trans-resveratrolo con l'HSA nel periodo simulato fino a 100 ns.Per lo studio della stabilità del sistema, sono stati calcolati i valori delle deviazioni quadratiche medie (RMSD) della spina dorsale HSA (C–Cα–N) e del complesso HSA-T-res e il grafico è stato tracciato da 0 a 100 ns.Dalla Fig. 13a, è chiaro che il valore RMSD della sola HSA era stabile da 0 a 40 ns, ed è stato aumentato da 40 a 60 ns e successivamente è tornato stabile da 60 a 100 ns.Per il complesso HSA-T-res, il valore RMSD aumenta costantemente da 0 a 20 ns.Da 40 a 100 ns, il sistema si stabilizza e non si ottiene alcun aumento o diminuzione significativa del valore RMSD e il sistema raggiunge l'equilibrio suggerendo che HSA e trans-resveratrolo sono costantemente legati all'HSA nel sottodominio IIA.Durante il tempo simulato di 100 ns, il valore RMSD dell'HSA e del complesso trans-resveratrolo era inferiore al valore RMSD del solo HSA, questo suggerisce anche la stabilità del sistema HSA dopo il legame con la molecola del trans-resveratrolo.I valori RMSD di HSA ottenuti nel presente studio sono in buon accordo con gli studi precedentemente riportati55.Analisi di simulazione MD dell'interazione di legame tra HSA e trans-resveratrolo che mostra (a) grafico RMSD per 100 ns simulazione, (b) grafico RMSF che mostra le fluttuazioni dei residui nel complesso HSA e HSA-T-res.Sono stati valutati anche i valori di fluttuazione quadrata media della radice (RMSF) per HSA da solo e per il complesso HSA-trans-resveratrolo per esplorare la flessibilità della proteina56.La Figura 13b mostra il grafico dei valori RMSF rispetto ai residui di amminoacidi in HSA.Si deduce che i residui di amminoacidi nel sottodominio IIA sono più rigidi rispetto ad altre regioni a causa della complessa formazione tra HSA e trans-resveratrolo.A causa della presenza di bobine casuali all'estremità dell'elica, si osserva flessibilità ai residui finali, come mostrato in Fig. 13b.(4)vol.int.Nutr.fr.int.Sci.Davanti.int.Nutr.Mol.Nutr.int.Davanti.Sono.J.Clin.Nutr.Sci.int.Sci.Sci.Mol.Sci.Protoc.Biol.Davanti.Biol.Corr.Euro.Euro.