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danni al DNA neuronale.Tuttavia, la dopamina e il fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF) aumentano il TyrRS e la ribosilazione dell'istone serina-ADP.Inoltre, il cis-resveratrolo (cis-RSV) che si lega al TyrRS imitando una conformazione "senza tirosina" aumenta il TyrRS, facilita la riparazione del DNA dipendente dalla ribosilazione dell'istone serina-ADP e fornisce neuroprotezione in modo TyrRS-dipendente.Al contrario, il trans-RSV che si lega al TyrRS imitando una conformazione "simile alla tirosina" diminuisce il TyrRS, inibisce la riparazione del DNA serina-ADP-ribosilazione-dipendente e induce la neurodegenerazione nei neuroni corticali del ratto.I nostri risultati suggeriscono che l'aumento dei livelli di tirosina sierico associato all'età può influenzare disturbi neurocognitivi e metabolici e offrire una spiegazione plausibile per risultati divergenti ottenuti negli studi clinici con resveratrolo.La tirosil-tRNA sintetasi (TyrRS, nota anche come YARS1) appartiene alla famiglia delle aminoacil-tRNA sintetasi (aaRSs) e attiva l'amminoacido aromatico (AAA) tirosina per la sintesi proteica1.Sebbene la tirosina esista come enantiomeri (L- e D-tirosina) e il TyrRS possa attivarli entrambi2, solo la L-tirosina viene utilizzata per la sintesi proteica1,2.Allo stesso modo, solo L-Tyr (Tyr), non D-Tyr, è un substrato per la fase di limitazione della velocità nella sintesi della dopamina3 catalizzata dalla tirosina idrossilasi (TH).La tirosina sierica è regolata circadiana, con i livelli più alti al mattino e più bassi a mezzanotte (ora del sonno)4.È interessante notare che la sintesi proteica cerebrale5, la formazione della memoria6 e la riparazione del DNA neuronale7 vengono attivate durante il sonno quando i livelli di tirosina diminuiscono durante il nadir/trough del ritmo circadiano.I livelli di tirosina sono anche modulati dalle attività circadiane di TH, tirosina aminotransferasi (TAT) e microbiota intestinale.Le mutazioni genetiche che aumentano i livelli di tirosina (tirosinemia) o il suo precursore L-fenilalanina (Phe, fenilchetonuria [PKU]) causano molteplici problemi di salute, inclusi deficit cognitivi nei bambini.Inoltre, la tirosina esacerba il declino cognitivo negli anziani8 e nei pazienti con malattia di Alzheimer (AD)9 e guida la degenerazione assonale e la demielinizzazione nei pazienti con tirosinemia10.Sebbene la sintesi proteica sia necessaria per la formazione della memoria a lungo termine11 e il fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF) stimoli la sintesi de novo di TyrRS nei neuroni12, una recente analisi proteomica cerebrale13 ha mostrato che il TyrRS è diminuito nelle regioni cerebrali colpite dei pazienti con AD13 a causa di un fattore sconosciuto meccanismo.Pertanto, l'identificazione dei fattori endogeni e dei loro meccanismi d'azione che modulano i livelli di TyrRS possono fornire approfondimenti sulla fisiopatologia dell'AD e di altri disturbi neurocognitivi e metabolici.La restrizione calorica (CR) promuove la stabilità genomica attraverso l'induzione della riparazione dell'escissione della base (BER) e l'inversione del suo declino correlato all'età14 insieme a un'estensione della durata della vita e alla protezione contro i disturbi neurocognitivi e metabolici associati all'età, comprese le malattie cardiovascolari (CVD).Sebbene le analisi metaboliche mostrino che la CR riduce i livelli di tirosina sierica15 e che i pazienti con tirosinemia hanno ridotto la durata della vita10, non è noto se la tirosina modula direttamente l'invecchiamento e i disturbi associati all'età.Ancora più importante, la molecola naturale del resveratrolo (RSV) che mostra somiglianza con la tirosina (entrambi contengono un gruppo fenolico) ha dimostrato benefici per la salute simili al CR negli esseri umani16, suggerendo che l'RSV può agire come un "mimetico CR"16.Curiosamente, gli studi clinici che utilizzano l'isomero trans di RSV (trans-RSV) hanno rivelato risultati contrastanti.Dosi più basse di trans-RSV hanno prodotto risultati incoraggianti, ma dosi più elevate hanno esacerbato le malattie.Ad esempio, il trans-RSV a basse dosi ha mostrato benefici simili alla CR nei maschi obesi16, benefici cognitivi nei pazienti con AD17 e nelle donne in postmenopausa18, protezione contro l'insufficienza cardiaca19 e chemioprevenzione del cancro20.Tuttavia, dosi più elevate (≥200 mg/die) di trans-RSV hanno provocato una perdita di volume cerebrale nei pazienti con AD21, un peggioramento delle prestazioni della memoria nella schizofrenia22, un peggioramento del profilo metabolico nei pazienti diabetici23 e un aumento del rischio di CVD negli anziani24.Nonostante decenni di ricerca, le basi molecolari di questi controversi effetti del trans-RSV (effetti benefici simili a CR a basse dosi16,17,18,19,20 contro effetti dannosi a dosi elevate21,22,23,24) rimangono sconosciuti25.Sebbene l'RSV esista come una miscela di cis-RSV e trans-RSV, studi recenti hanno dimostrato che i metaboliti solfati di trans-RSV che forniscono un pool intracellulare26 generano principalmente cis-RSV27.In precedenza abbiamo dimostrato che cis e trans-RSV imitano la tirosina e si legano a TyrRS28.Tuttavia, cis-RSV induce una conformazione unica "senza tirosina" in TyrRS25.Poiché il CR riduce i livelli di tirosina15, abbiamo proposto che cis-RSV possa abilitare le funzioni nucleari al chiaro di luna di TyrRS anche in presenza di tirosina e quindi, cis-RSV possa agire come un potenziale "CR mimetico"25,28.In precedenza abbiamo dimostrato che la tirosina inibisce l'auto-poli-ADP-ribos(PAR)ilazione mediata da TyrRS della poli-ADP-ribosio polimerasi 1 (PARP1) e la segnalazione di stress associata28.Coerentemente, l'auto-PARilazione di PARP1 è regolata circadiano in modo dipendente dall'alimentazione, in cui l'alimentazione che aumenta i livelli di tirosina inibisce l'auto-PARilazione29.Queste osservazioni hanno suggerito che le funzioni nucleari di TyrRS sono tipicamente attivate quando il livello di tirosina è diminuito durante il nadir/trough del ritmo circadiano.Tuttavia, abbiamo anche dimostrato che trans-RSV a concentrazione inferiore adatta la sua conformazione cis (cis-RSV) per attivare l'auto-PARilazione TyrRS-dipendente di PARP128.Sebbene l'auto-PARilazione di PARP1 sia essenziale per BER30 e il sonno attivi la riparazione del DNA neuronale7, non è ancora noto se cis-RSV consentirebbe la riparazione del DNA dipendente da TyrRS/PARP1.Inoltre, il valore Ki apparente dell'inibizione mediata da trans-RSV dell'attivazione della tirosina da parte di TyrRS in un test di scambio ATP-PPi (Tyr + ATP → Tyr-AMP + PPi) è ~ 25 μM28, suggerendo che trans-RSV può mantenere la sua trans conformazione (che imita la conformazione "simile alla tirosina") a concentrazioni più elevate (≥25 μM)25,28.Tuttavia, non è ancora noto se il trans-RSV inibirebbe la riparazione del DNA dipendente da TyrRS/PARP1, in particolare l'auto-PARilazione di PARP125,28.Soprattutto, gli studi clinici che utilizzano 5 e 1000 mg di trans-RSV (>99% trans-RSV) hanno riportato concentrazioni plasmatiche di picco rispettivamente di 0,6 e 137 μM di RSV20 e altri studi clinici che utilizzano 1000 mg/die di trans-RSV per 29 giorni hanno riportato un accumulo di 50-640 μM di trans-RSV nei tessuti umani26, suggerendo che questo regime di trattamento potrebbe ottenere effetti trans-RSV-mediati ad alte dosi (≥25 μM) nell'uomo.Abbiamo scoperto che l'aumento dei livelli di tirosina diminuisce il TyrRS e causa il danno ossidativo neuronale al DNA inibendo contemporaneamente la sintesi proteica e la riparazione del DNA.Tuttavia, la dopamina e il BDNF hanno stimolato la sintesi de novo del TyrRS neuronale.Inoltre, mostriamo che cis e trans-RSV hanno effetti opposti sui livelli di TyrRS, sulla sintesi proteica, sulla riparazione del DNA e sulla sopravvivenza dei neuroni corticali di ratto.cis-RSV protegge i neuroni dalla tirosina e dall'esaurimento del TyrRS indotto da altri agenti neurotossici e dal danno al DNA.Soprattutto, mostriamo che trans-RSV evoca effetti dicotomici a seconda della dose, esercitando neuroprotezione a concentrazioni inferiori (≤10 μM) ma inducendo ed esacerbando la neurotossicità a concentrazioni più elevate (≥25 μM).Questo effetto dicotomico era correlato alle transizioni isomeriche del trans-RSV in soluzione e ai livelli di TyrRS, dove la maggior parte del trans-RSV viene convertito in cis-RSV a basse concentrazioni27,28 che aumentano i livelli di TyrRS e attivano la riparazione del DNA neuronale (potenzialmente imitando il CR-come protettivo effetti) ma rimane nella conformazione trans ad alte concentrazioni causando potenzialmente effetti tossici simili alla tirosina come l'esaurimento del TyrRS, l'inibizione della sintesi proteica e l'induzione della neurodegenerazione associata al danno del DNA.Pertanto, oltre a spiegare gli effetti opposti del trans-RSV ad alto e basso dosaggio riscontrato negli studi clinici, i nostri risultati forniscono anche una potenziale base molecolare per l'aumento associato all'età del danno neuronale al DNA e del declino cognitivo dovuto all'aumento associato all'età nei livelli di tirosina sierica.L'AD diminuisce la sintesi proteica cerebrale nella fase di allungamento nell'uomo31,32,33,34 attraverso un meccanismo sconosciuto.Il proteoma cerebrale umano pubblicato di recente ha mostrato livelli ridotti di TyrRS e fenilalalanil-tRNA sintetasi beta (PheRSβ) nelle regioni cerebrali affette da AD13 (Figura 1a, b supplementare).Abbiamo convalidato l'osservazione che TyrRS e PheRSβ sono esauriti nella regione dell'ippocampo dei pazienti con AD.Tuttavia, il livello di PheRSα non è stato influenzato (Fig. 1a e Tabella 1 supplementare).La nostra rianalisi di un secondo proteoma cerebrale35 ha mostrato che i livelli proteici di TyrRS e PheRSβ sono correlati con le prestazioni cognitive negli esseri umani (Figura 1c supplementare)35.Al contrario, la loro diminuzione è correlata allo stato di AD e agli stadi di Braak (Figura 1d supplementare)35.È interessante notare che una meta-analisi dei dati trascrittomici del cervello umano di pazienti con AD non ha mostrato alcun cambiamento nei livelli di mRNA di TyrRS e PheRSβ36.Mentre la traduzione di PheRSβ diminuisce in modo dipendente dall'età (Figura 1e supplementare)37, i livelli di TyrRS non erano correlati con nessun biomarcatore noto di AD o altre malattie neurodegenerative (Figura 1f supplementare)35, indicando che fattori fino ad ora sconosciuti potrebbero modulare livelli di proteina TyrRS neuronale.a Immunoblot rappresentativi e quantificazione per TyrRS e PheRSα/β utilizzando anticorpi anti-TyrRS e PheRSα/β nella regione dell'ippocampo di pazienti con AD (n = 7) con controlli abbinati per età e sesso (n = 7).b La tirosina riduce preferenzialmente i livelli nucleari e neuriti di TyrRS.Immagini spettrali (barra della scala, 20 µm) e analisi IF quantitativa di TyrRS nel nucleo, soma e neurite dei neuroni corticali di ratto (DIV 9) utilizzando anticorpi anti-TyrRS dopo trattamento con L-tirosina (250 µM) per 4 ore ( n = 3).c La riduzione del livello di tirosina aumenta i livelli nucleari e neuriti di TyrRS.Immagini spettrali (barra della scala, 20 µm) e analisi IF quantitativa di TyrRS nel nucleo, nel soma e nel neurite dei neuroni corticali di ratto (DIV 9) utilizzando l'anticorpo anti-TyrRS dopo il trattamento con un mezzo a bassa tirosina per 2 ore come descritto nei metodi ( n = 3).d La riduzione dei livelli di tirosina aumenta i livelli di proteina TyrRS totale.Immunoblot rappresentativi che mostrano il TyrRS totale dopo il trattamento con un mezzo a bassa tirosina per 2 ore nei neuroni corticali di ratto (DIV 9) utilizzando l'anticorpo anti-TyrRS (n = 3).e La tirosina esaurisce TyrRS e PheRSβ, ma non PheRSα.I neuroni corticali di ratto sono stati trattati con L-tirosina (100-300 μM) per 4 ore.I livelli di PheRSβ e PheRSα sono stati rilevati mediante analisi WB utilizzando i loro anticorpi specifici (n = 3).f Il knockdown di TyrRS mediante siRNA induce la degenerazione dei neuriti.Immagini rappresentative (barra della scala, 20 µm) per i neuroni corticali 72 ore dopo la trasfezione siRNATyrRS (MAP2 - marcatore neurite, magenta e DAPI - marcatore nucleare, blu).I neuroni sono stati sottoposti a test immunologico con anticorpi anti-MAP2 e quantificati per la degenerazione dei neuriti.I dati sono presentati come media ± SEM per n = 3 esperimenti.La significatività statistica è stata misurata utilizzando un t-test spaiato a due code.I dati di origine vengono forniti come file di dati di origine.L'invecchiamento è il fattore di rischio più forte per le malattie neurodegenerative e, cosa interessante, l'incidenza dell'AD e di altre demenze è maggiore nelle donne rispetto agli uomini.I livelli sierici di tirosina aumentano durante l'invecchiamento e anche i livelli di tirosina sono aumentati nei tessuti cerebrali dell'AD.È interessante notare che le giovani donne hanno livelli di tirosina sierica più bassi rispetto ai giovani uomini.Tuttavia, la menopausa aumenta i livelli di tirosina sierica, con conseguente aumento significativo dei livelli di tirosina sierica nelle donne anziane (Figura 2a supplementare e Tabella 2 supplementare).Oltre alle malattie neurodegenerative, l'invecchiamento negli esseri umani è anche associato a una maggiore incidenza di altre malattie.Coerentemente, la nostra analisi della letteratura ha mostrato che la tirosina e/o la fenilalanina sono aumentate durante delirio, insufficienza cardiaca (HF), morbo di Parkinson (PD), disturbi dello spettro autistico (ASD), CVD e altri disturbi metabolici (Figura 2b supplementare e Tabella supplementare 3).È interessante notare che l'aumento dei livelli di tirosina e/o fenilalanina inibisce la sintesi proteica38,39, induce danni al DNA40 e promuove lo stress ossidativo nel cervello41 in vivo nei ratti.Poiché l'AD riduce i livelli di TyrRS (Fig. 1a) e la sintesi proteica cerebrale31,32,33,34, abbiamo ipotizzato che l'aumento dei livelli di tirosina possa regolare negativamente i livelli di proteina TyrRS e causare danni al DNA ossidativo neuronale.Per determinare se il trattamento con tirosina modula i livelli di TyrRS, abbiamo trattato i neuroni corticali di ratto (DIV 9/10) con concentrazioni crescenti di tirosina.Coerentemente con la nostra ipotesi, la tirosina ha diminuito il TyrRS nei neuroni (DIV 9/10) (Fig. 1b) con effetti preferenziali nel nucleo e nei neuriti (Fig. 1b).Al contrario, la riduzione dei livelli di tirosina nel mezzo di coltura ha aumentato i livelli di TyrRS nel nucleo e nei neuriti (Fig. 1c, d).Sebbene la tirosina abbia impoverito PheRSβ, non ha influenzato i livelli di PheRSα (Fig. 1e).Allo stesso modo, anche la fenilalanina, la 3,4-diidrossi-L-fenilalanina (L-DOPA) e la 6-idrossidopamina (6-OHDA) hanno ridotto i livelli di TyrRS e PheRSβ (Figura 3a-c supplementare), suggerendo che anche i derivati ​​del metabolismo della tirosina regolano negativamente il TyrRS.Sebbene sia una proteina essenziale, in precedenza abbiamo dimostrato che circa il 75% di knockdown di TyrRS utilizzando siRNA (siRNATyrRS) non influisce sulla vitalità cellulare28.Tuttavia, siRNATyrRS nei neuroni corticali (~ 50% di knockdown) ha provocato una robusta degenerazione dei neuriti (Fig. 1f e Fig. 3d supplementare), indicando un ruolo critico di TyrRS nel mantenimento della stabilità dei neuriti.Inoltre, dati di spettrometria di massa pubblicati di recente hanno mostrato che TyrRS rimane fortemente ubiquitinato nella cellula42 e la sua deubiquitinazione (insieme ad altri aaRS) facilita il recupero della sintesi proteica durante la fase di recupero dopo lo stress42.Per determinare se la tirosina sfrutta la via proteasomica o lisosomiale (autofagia) per la degradazione di TyrRS insieme alla sua capacità di inibire la sintesi proteica38,39, abbiamo eseguito ulteriori esperimenti utilizzando inibitori dell'autofagia (bafilomicina), proteasoma (MG132) e sintesi proteica (cicloesimide, CHX).Il trattamento con bafilomicina e MG132 ha aumentato i livelli di TyrRS, suggerendo che sia il proteasoma che il lisosoma sono coinvolti nella degradazione costitutiva di TyrRS (Figura 3e, f supplementare).Tuttavia, la cicloesimmide ha ridotto i livelli di TyrRS (Figura 3g supplementare), suggerendo che è necessaria una sintesi de novo sostenuta per mantenere i livelli omeostatici di TyrRS in condizioni normali.Al contrario, la deubiquitinazione può stabilizzare TyrRS in condizioni di stress42.La sintesi proteica è regolata principalmente nelle fasi di inizio e allungamento.La fosforilazione Ser51 del fattore di iniziazione eucariotica 2 alfa (p-eIF2α) da parte di più chinasi e la fosforilazione Thr56 del fattore di allungamento eucariotico 2 (p-eEF2) da parte della chinasi eEF2 (eEF2K) inibiscono la sintesi proteica nelle fasi di inizio e allungamento, rispettivamente.Il bersaglio della rapamicina dei mammiferi della protein chinasi (mTOR) inibisce eEF2K e attiva la sintesi proteica (Figura 4a supplementare).Sebbene sia controintuitivo che un livello elevato di tirosina sia inibitorio del TyrRS e della sintesi proteica in modo indipendente da p-eIF2α38,39, per il quale è richiesto, abbiamo anche notato che la tirosina attiva istantaneamente l'assemblaggio del fattore di iniziazione eucariotica 4 F (eIF4F) e fosforilazione della proteina ribosomiale S6 chinasi beta-1 (S6K1)39.Ancora più importante, nonostante una significativa diminuzione dei livelli di TyrRS dei neuriti, sorprendentemente, la tirosina non ha indotto la degenerazione dei neuriti (Fig. 1b) e i livelli di TyrRS sono stati ripristinati in 16-24 ore (Fig. 2a).Queste osservazioni suggeriscono che l'effetto della tirosina su TyrRS è reversibile e fattori neurotrofici che attivano la sintesi proteica possono stimolare la sintesi de novo di TyrRS.Il neurotrasmettitore dopamina (DA), che diminuisce durante l'invecchiamento, e nelle regioni cerebrali colpite dei pazienti con AD, è generato dalla tirosina (L-Tyr → L-DOPA → DA).È interessante notare che DA è noto per attivare eEF243, potenzialmente attivando mTOR, stimolando sia la sintesi proteica che la formazione della memoria44.Poiché il BDNF, che è anche esaurito nel cervello di AD, attiva eEF2 e stimola la sintesi de novo di TyrRS12 (Figura 4b, c supplementare), ci siamo chiesti se DA aumenterebbe anche i livelli di TyrRS.Coerentemente con la nostra ipotesi, il trattamento con DA ha aumentato i livelli di TyrRS (Fig. 2b e Fig. 4d supplementare) e gli effetti di DA sono stati annullati dalla rapamicina (Rapa) (Fig. 2c).Sebbene la tirosina non influisca sulla funzione eIF2α39, il trattamento con tirosina ha inibito eEF2 (Fig. 2d).Questi dati suggeriscono che oltre a facilitare la degradazione di TyrRS, la tirosina inibisce anche la sintesi de novo di TyrRS, potenzialmente nella fase di allungamento attraverso una maggiore fosforilazione di eEF2, mentre BDNF e DA stimolano la sintesi di TyrRS (Fig. 2e).un effetto della L-tirosina sui livelli della proteina TyrRS è reversibile.I neuroni corticali di ratto sono stati trattati con L-tirosina (200 μM) per un massimo di 24 ore e TyrRS è stato rilevato mediante analisi WB utilizzando anticorpi anti-TyrRS.b La dopamina (DA) aumenta i livelli neuronali di TyrRS.Immunoblot rappresentativi per TyrRS e PheRSα/β dopo il trattamento con DA (100–200 μM) per 30 minuti nei neuroni corticali di ratto (DIV 9).c La rapamicina previene l'aumento dei livelli di TyrRS indotto da DA.Immunoblot rappresentativi per TyrRS e PheRSβ dopo 30 minuti di trattamento con DA (100 μM) da solo o in combinazione con rapamicina (100 nM) nei neuroni corticali di ratto (DIV 9).d La tirosina induce la fosforilazione di eEF2.I neuroni corticali primari sono stati trattati con L-tirosina (100-300 μM) per 8 ore e p-eEF2 è stato rilevato mediante analisi WB utilizzando anticorpi anti-p-eEF2 (n = 5).e Rappresentazione schematica del potenziale meccanismo di regolazione dei livelli proteici neuronali di TyrRS.Tutti i dati rappresentano la media ± SEM per n = 3 esperimenti con significatività misurata utilizzando l'ANOVA a due vie con il test di Tukey per confronti multipli.I dati di origine vengono forniti come file di dati di origine.L'RSV naturale esiste come una miscela di cis-RSV e trans-RSV ed entrambi sono stabili per almeno sei settimane a 4 ° C e nella cellula per 24 ore 27.Studi clinici che utilizzano basse dosi di RSV trans (50–75 mg/dose, cioè; concentrazione plasmatica di 6–9 μM di trans-RSV/dose) hanno riportato benefici simili alla CR nelle donne in postmenopausa18 e nei pazienti con insufficienza cardiaca19.Al contrario, gli studi clinici con 1.000 mg/dose di trans-RSV hanno determinato una perdita di volume cerebrale nei pazienti con AD21 e un aumento del rischio di CVD negli anziani24.Tuttavia, abbiamo notato che un livello di tirosina più elevato è un biomarcatore comune per tutte le malattie/condizioni sopra menzionate (Tabella Supplementare 3).Poiché i livelli di TyrRS nel cervello sono correlati alle prestazioni cognitive negli esseri umani (Figura 1c supplementare) 35, abbiamo ipotizzato che cis-RSV e trans-RSV eserciterebbero effetti differenziali sui livelli di TyrRS neuronale e sulla sintesi proteica.Coerentemente con i risultati degli studi clinici, una bassa dose di trans-RSV (10 µM) ha aumentato il TyrRS e una dose elevata (50 µM) lo ha diminuito, mentre cis-RSV (10-50 µM) ha aumentato i livelli di TyrRS sia nel nucleo e neuriti (Fig. 3a, b e Fig. 5a, b supplementare), imitando gli effetti del livello ridotto di tirosina che aumenta il TyrRS nel nucleo e nei neuriti (Fig. 1c).cis-RSV ha salvato gli effetti della trans-RSV e della diminuzione mediata dalla tirosina dei livelli di TyrRS in modo dose-dipendente (Fig. 3c, d).Il trans-RSV ad alta concentrazione ha ridotto i livelli di PheRSβ, non di PheRSα, mentre cis-RSV ha aumentato i loro livelli (Fig. 3e e Fig. 5c, d).Inoltre, l'aumento del livello di TyrRS mediato da cis-RSV è stato abrogato da CHX (Fig. 3f), suggerendo che cis-RSV aumenta il TyrRS in modo dipendente dalla sintesi proteica.Mentre cis-RSV ha innescato un aumento transitorio dei livelli di p-eIF2α (Figura 5e, f supplementare), trans-RSV ha sostenuto l'inibizione di eIF2α (Figura 5e, f supplementare) e l'aumento dei livelli di p-eEF2 (Figura 3g ).Tuttavia, cis-RSV ha attivato la defosforilazione di eEF2 (Fig. 3g).Infine, coerentemente con l'esaurimento di TyrRS e l'aumento di p-eIF2α e p-eEF2, il trattamento con trans-RSV ha inibito la sintesi proteica globale misurata dal test di incorporazione della puromicina (Fig. 3h).Poiché la CR ha ridotto i livelli di tirosina15 e la diminuzione dei livelli di tirosina ha aumentato il TyrRS, presi insieme, questi dati indicano che cis-RSV può agire come un potenziale CR mimetico aumentando i livelli di TyrRS.a Concentrazioni basse e alte di trans-RSV (10 e 50 μM) hanno effetti opposti su TyrRS e basse concentrazioni di trans-RSV imitano cis-RSV.Immunoblot rappresentativi per TyrRS dopo il trattamento con cis-e trans-RSV (10 e 50 μM) nei neuroni corticali di ratto (DIV 9).b cis-e trans-RSV hanno effetti opposti su TyrRS.Immagini spettrali rappresentative (barra della scala, 20 µm) di TyrRS nei neuroni corticali di ratto (DIV 10) dopo il trattamento con cis-RSV o trans-RSV per 16 ore (MAP2 – neurite, magenta; DAPI – nucleo, blu; TyrRS – rosso -immagine spettrale gialla).c cis-RSV protegge i neuroni dalla diminuzione di TyrRS mediata da trans-RSV.Immunoblot rappresentativi che mostrano TyrRS dopo il trattamento con trans-RSV (50 μM) da solo o in combinazione con diverse dosi di cis-RSV per 4 ore.d cis-RSV protegge i neuroni dall'esaurimento del TyrRS mediato dalla tirosina.I neuroni corticali sono stati trattati con Tyr (200 μM) da solo o in combinazione con cis-RSV per 8 ore.e cis- e trans-RSV hanno effetti opposti sulla PheRSβ neuronale.Immunoblot rappresentativi per PheRSα/β dopo il trattamento con cis-e trans-RSV (5–50 μM) per 4 ore.f cis-RSV stimola la sintesi de novo di TyrRS.Immagini spettrali (barra della scala, 20 μm) dopo il trattamento con cis-RSV (50 μM) per 1 ora da solo o in combinazione con CHX (100 μg).g cis- e trans-RSV hanno effetti opposti sulla fosforilazione di eEF2.Immunoblot rappresentativi per p-eEF2 dopo il trattamento con cis- e trans-RSV (5-50 μM) per 8 ore.h trans-RSV inibisce la sintesi proteica globale.I neuroni corticali sono stati trattati con cis e trans-RSV (5-50 μM) per 1 ora, seguiti dall'incorporazione e rilevamento della puromicina utilizzando l'anticorpo anti-puromicina.i cis-RSV facilita l'interazione di PP2A con eEF2.I neuroni corticali sono stati trattati con cis- e trans-RSV (50 μM) o Tyr (200 μM) da soli o in combinazione con cis-RSV per 4 ore.EEF2 immunoprecipitato è stato sondato per la sua interazione con PP2A e TyrRS.Tutti i dati rappresentano la media ± SEM per n = 3 esperimenti con significatività misurata utilizzando l'ANOVA a due vie con il test di Tukey per confronti multipli.I dati di origine vengono forniti come file di dati di origine.Poiché eEF2 regola la fase di allungamento della sintesi proteica ed eEF2K è l'unica chinasi nota che inibisce eEF2 (Figura 4a supplementare), ci siamo chiesti se l'attivazione farmacologica diretta di eEF2K utilizzando nelfinavir45 esaurisse TyrRS.È interessante notare che nelfinavir ha esaurito il TyrRS neuronale, che è stato salvato da cis-RSV (Figura 6a, b supplementare), suggerendo che la sintesi proteica è necessaria per mantenere i livelli di TyrRS in condizioni normali.In precedenza abbiamo dimostrato che la riduzione genetica di eEF2K attenua i deficit di memoria legati all'età nei topi46.Coerentemente, abbiamo scoperto che TyrRS e PheRSβ erano aumentati nei campioni di tessuto cerebrale dei topi eEF2K +/- (Figura 6c supplementare).Per determinare il meccanismo dell'attivazione mediata da cis-RSV di eEF2 attraverso la defosforilazione, abbiamo testato se cis e trans-RSV modulano l'interazione di TyrRS con eEF2 e proteina fosfatasi 2 (PP2A) (Figura 4a supplementare).Abbiamo scoperto che cis-RSV ha facilitato l'interazione di eEF2 con TyrRS e PP2A, mentre trans-RSV e tirosina hanno ridotto le loro interazioni (Fig. 3i).Questi dati suggeriscono che cis-RSV e tirosina modulano i livelli di TyrRS nella fase di allungamento e cis-RSV imita DA e BDNF nell'attivare la sintesi de novo di TyrRS (Fig. 2e).Inoltre, in modo simile al 6-OHDA (Figura 3c supplementare), anche altri agenti neurotossici come l'N-metil-D-aspartato (NMDA) e la tossina mitocondriale 1-metil-4-fenilpiridinio (MPP+) hanno ridotto i livelli di neurone TyrRS dopo 4 ore di trattamento (Figura 6d, e supplementare);cis-RSV ha soppresso questo effetto, mentre trans-RSV lo ha esacerbato (Figura 6d, e supplementare), suggerendo che il TyrRS neuronale è un potenziale bersaglio di molteplici agenti neurotossici.La regolazione di eIF2α modula le funzioni motorie e cognitive e la sopravvivenza neuronale in un meccanismo di attivazione del fattore di trascrizione 4 (ATF4)-dipendente11.È interessante notare che TyrRS (ma non PheRSβ) è tra i geni bersaglio dell'ATF4 sovraregolati durante la risposta allo stress integrata (ISR)47.Poiché l'attivazione farmacologica della sintesi proteica utilizzando l'inibitore della risposta allo stress integrato (ISRIB) protegge dai deficit di memoria legati all'età48, abbiamo testato se ISRIB proteggesse dall'esaurimento del TyrRS mediato dal trans-RSV.Il trattamento con ISRIB (5–50 nM) ha aumentato i livelli proteici di TyrRS e PheRSβ (Fig. 4a), ha salvato l'esaurimento mediato da trans-RSV di TyrRS (Fig. 4b) e ha stimolato la defosforilazione di eEF2 (Fig. 4a), potenzialmente mediato da TyrRS.Tuttavia, dosi più elevate di ISRIB (250–500 nM) hanno ridotto i livelli di TyrRS (Fig. 4c).Poiché non abbiamo alcuna indicazione che la regolazione dell'espressione genica durante l'ISR sia diversa nei neuroni e l'ISRIB inibisce l'espressione del gene bersaglio di ATF448, la diminuzione dipendente dalla concentrazione del livello di TyrRS è probabilmente dovuta alla repressione di TyrRS a dosi più elevate di ISRIB, fornendo un potenziale base molecolare per effetti tossici mediati da ISRIB in modelli animali.Poiché la tirosina ha ridotto i livelli di TyrRS dei neuriti (Fig. 1b) e il sonno stimola la sintesi proteica sinaptica49, ci siamo anche chiesti se il TyrRS sinaptico sia regolato circadiano.La nostra rianalisi dei dati proteomici e metabolomici circadiani del topo ha mostrato che il livello di proteina sinaptica del solo TyrRS (tra tutti gli aaRS) è regolato circadiano ed è inversamente correlato ai livelli di tirosina (Figura 7a supplementare)49.Inoltre, una nuova analisi del metaboloma umano ha mostrato che la privazione del sonno aumenta i livelli di tirosina sierica (Figura 7b supplementare).Collettivamente, questi dati suggeriscono che la tirosina è un potenziale modulatore endogeno del TyrRS sinaptico e nucleare.a Cis-RSV e trans-RSV hanno effetti opposti sull'accumulo mediato dalla tirosina di γ-H2AX.Immagini di immunocolorazione (barra della scala, 10 µm) per marker di danno al DNA, focolai pSer139-H2AX (γ-H2AX, verde; DAPI – marker nucleare, blu) nei neuroni corticali (DIV 10) dopo trattamento con cis- e trans-RSV (50 µM) da solo o in combinazione con L-tirosina (250 µM) per 24 ore.Il grafico rappresenta il numero medio di fuochi γ-H2AX per n = 30 neuroni per condizione di trattamento per n = 3 esperimenti.b cis- e trans-RSV hanno effetti opposti sull'induzione mediata dalla tirosina del danno ossidativo nel DNA neuronale.Quantificazione dei livelli di 8-oxo-2'-dG mediante immunofluorescenza (IF) nei neuroni corticali primari di ratto (DIV 9/10) dopo trattamento con L-tirosina (500 μM) da solo o in combinazione con cis o trans-RSV (50 μM) per 16 ore per n = 3 esperimenti.c D-tirosina e trans-RSV inducono la degenerazione dei neuriti.Immagini rappresentative (barra della scala, 20 µm) per i neuroni corticali dopo D-tirosina o cis-RSV e trans-RSV (50 µM) per 24 ore di trattamento (MAP2 - marcatore neurite, magenta e DAPI - marcatore nucleare, blu).I neuroni sono stati sottoposti a test immunologico con anticorpi anti-MAP2 e quantificati per la degenerazione dei neuriti.d Saggio della cometa che misura l'entità delle rotture del filamento di DNA indotte da tirosina e trans-RSV.I neuroni corticali (DIV 9/10) sono stati trattati con cis-RSV (50 µM), trans-RSV (50 µM), L-tirosina (1 mM) da soli o in combinazione per 1 ora e la percentuale di DNA nel le code di comete sono state quantificate come descritto nei Metodi.Tutti i dati rappresentano la media ± SEM per n = 3 esperimenti indipendenti con significatività misurata utilizzando l'ANOVA a due vie con il test di Tukey per confronti multipli.L'invecchiamento umano e le malattie neurodegenerative accumulano mutazioni ossidative associate al danno del DNA nei neuroni50 mentre la CR protegge dallo stress ossidativo14.Mentre la privazione del sonno provoca danni ossidativi al DNA, il sonno stimola la riparazione del DNA neuronale7.Poiché TyrRS ha un ruolo nella segnalazione della risposta al danno del DNA (DDR)28, abbiamo ipotizzato che la diminuzione dei livelli di tirosina durante la notte potrebbe cambiare la funzione di una frazione di TyrRS dalla sintesi proteica alla riparazione del DNA.Al contrario, l'invecchiamento e le malattie neurodegenerative che aumentano i livelli di tirosina (Figura 2 supplementare) potrebbero inibire la riparazione del DNA mediata da TyrRS.Coerentemente con la nostra ipotesi, il trattamento con tirosina ha portato all'accumulo di focolai γ-H2AX (un marker di danno al DNA) e 8-oxo-2′-deossiguanosina (8-oxo-dG, un marker di danno ossidativo al DNA) (Fig. 5a,b).Queste osservazioni hanno indicato che i composti che imitano la conformazione "simile alla tirosina" in TyrRS potrebbero indurre un danno ossidativo al DNA.Al contrario, i composti che imitano una conformazione "senza tirosina" in TyrRS possono spostare la sua funzione per facilitare la riparazione del DNA neuronale.Per testare questa possibilità, abbiamo trattato colture neuronali con cis-RSV, che evoca una conformazione "senza tirosina"25, e trans-RSV, che imita una conformazione "simile alla tirosina" in TyrRS28.Mentre cis-RSV ha salvato l'accumulo indotto dalla tirosina di γ-H2AX e 8-oxo-dG, lo stesso trans-RSV ha causato l'accumulo di γ-H2AX e 8-oxo-dG (Fig. 5a, b).È interessante notare che cis-RSV ha ridotto i livelli di γ-H2AX nelle colture neuronali anche dopo 12 ore di pretrattamento con tirosina che aveva già causato un danno sostanziale al DNA (Figura 8a supplementare), suggerendo che oltre alla prevenzione, cis-RSV può invertire il danno neuronale al DNA esistente .Inoltre, la tirosina ha ridotto i livelli di 8-ossoguanina-DNA glicosilasi (OGG1) (Figura 8b supplementare), che è stata salvata da cis-RSV (Figura 8c supplementare).8-oxo-dG è altamente mutageno, guidando una trasversione GC → TA.Coerentemente, la frequenza mutagena aumenta durante l'invecchiamento e γ-H2AX e 8-oxo-dG si accumulano nei neuroni invecchiati e AD50,51.Inoltre, D-Tyr, che non viene convertito in DA3 ma è attivato da TyrRS2, ha indotto neurotossicità, mentre D-Phe e D-Trp non hanno avuto effetti significativi (Fig. 5c e Fig. 8d, e).cis-RSV ha protetto dalla neurotossicità mediata da D-Tyr, mentre il trans-RSV ha esacerbato la tossicità (Figura 8f supplementare).Abbiamo anche condotto il test della cometa per ottenere prove dirette del danno al DNA.Abbiamo trattato i neuroni corticali di ratto con trans-RSV e L-tirosina da soli o in combinazione.Abbiamo scoperto che sia trans-RSV, L-tirosina e la loro combinazione hanno aumentato significativamente il danno al DNA misurato dall'aumento della percentuale (%) di DNA nella coda della cometa (Fig. 5d).soc.esp.esp.Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.Spiacenti, un link condivisibile non è attualmente disponibile per questo articolo.