Javascript è attualmente disabilitato nel tuo browser.Diverse funzionalità di questo sito non funzioneranno mentre javascript è disabilitato.accesso aperto alla ricerca scientifica e medicaDalla presentazione alla prima decisione editoriale.Dall'accettazione editoriale alla pubblicazione.La suddetta percentuale di manoscritti è stata respinta negli ultimi 12 mesi.Riviste scientifiche e mediche peer-reviewed ad accesso libero.Dove Medical Press è membro dell'OAI.Ristampe in blocco per l'industria farmaceutica.Offriamo vantaggi reali ai nostri autori, inclusa l'elaborazione accelerata degli articoli.Registra i tuoi dettagli specifici e farmaci specifici di interesse e abbineremo le informazioni fornite agli articoli dal nostro ampio database e ti invieremo prontamente copie PDF via e-mail.Torna a Diari » Progettazione, sviluppo e terapia di farmaci » Volume 13Il ginsenoside Rg3 protegge le cellule di leydig del topo dal triptolide mediante la downregulation di miR-26aAutori Liang H, Zhang S, Li ZPubblicato il 24 giugno 2019 Volume 2019:13 Pagine 2057—2066DOI https://doi.org/10.2147/DDDT.S208328Revisione tramite revisione tra pari anonima singolaEditore che ha approvato la pubblicazione: Dr Anastasios LymperopoulosHaiyan Liang,1 Suwei Zhang,2 Zhiling Li1 1Centro riproduttivo, il primo ospedale affiliato dello Shantou University Medical College, Shantou University, Shantou, Guangdong 515031, Repubblica popolare cinese;2Dipartimento di Medicina di Laboratorio Clinico, Ospedale Centrale di Shantou, Shantou, Guangdong 515031, Repubblica Popolare Cinese Contesto: È stato segnalato che il ginsenoside Rg3 esercita una funzione di protezione sulle cellule germinali.Tuttavia, i meccanismi con cui Rg3 regola l'apoptosi nelle cellule di Leydig di topo rimangono poco chiari.Inoltre, è stato segnalato che il triptolide (TP) induce infertilità nei ratti maschi.Pertanto, questo studio mirava a studiare l'effetto protettivo di Rg3 contro la tossicità indotta da TP nelle cellule MLTC-1.Metodi: CCK-8, test di immunofluorescenza, Western blotting e citometria a flusso sono stati utilizzati per rilevare rispettivamente la proliferazione cellulare e l'apoptosi cellulare.Inoltre, il test del sistema reporter della doppia luciferasi è stato utilizzato per rilevare l'interazione tra miR-26a e GSK3β nelle cellule MLTC-1.Risultati: TP ha inibito significativamente la proliferazione delle cellule MLTC-1, mentre l'effetto inibitorio di TP è stato invertito da Rg3.Inoltre, TP ha indotto marcatamente l'apoptosi nelle cellule MLTC-1 aumentando le espressioni di Bax, caspasi attiva 3, Cyto c e caspasi attiva 9 e diminuendo il livello di Bcl-2.Tuttavia, Rg3 ha alleviato l'apoptosi indotta da TP delle cellule MLTC-1.Inoltre, il livello di miR-26a è stato ovviamente sottoregolato dal trattamento con Rg3.L'effetto protettivo di Rg3 contro la tossicità indotta da TP nelle cellule MLTC-1 è stato abolito dalla sovraregolazione del miR-26a.Nel frattempo, il test della doppia luciferasi ha mostrato che GSK3β era l'obiettivo diretto di miR-26a nelle cellule MLTC-1.La sovraespressione di miR-26a ha notevolmente ridotto il livello di GSK3β.Come previsto, la sovraregolazione di miR-26a potrebbe abrogare gli effetti protettivi di Rg3 contro la citotossicità indotta da TP inibendo l'espressione di GSK3β.Conclusione: questi risultati hanno indicato che Rg3 potrebbe proteggere MLTC-1 dal TP mediante la downregulation di miR-26a.Pertanto, Rg3 potrebbe fungere da potenziale agente per il trattamento dell'ipogonadismo maschile.Parole chiave: ginsenoside Rg3, ipogonadismo maschile, triptolide, cellula MLTC-1, apoptosiL'ipogonadismo maschile è solitamente correlato a impotenza, infertilità o riduzione della spermatogenesi.1 Il testosterone, un ormone vitale, è necessario per la spermiogenesi e il mantenimento delle funzioni sessuali secondarie negli uomini.2 Negli ultimi anni, circa il 6% dei maschi è stato attaccato da uomini ipogonadismo.3 La carenza di testosterone sierico nei maschi non solo porta a disfunzioni sessuali maschili, ma induce anche altre malattie, come obesità, atrofia muscolare scheletrica e diabete.4-7 Il testosterone viene generato nelle cellule di Leydig, mentre con l'aumentare dell'età, il numero di cellule di Leydig si ridurrà.8 Il numero di cellule di Leydig è strettamente associato al sistema riproduttivo maschile e alla funzione sessuale.9 Pertanto, il miglioramento della motilità e dell'ipogonadismo degli spermatozoi maschili è utile per migliorare la funzione sessuale, la fertilità e la qualità della vita dei maschi.Il Panax ginseng è una medicina erboristica cinese comune in Oriente.10 Il ginsenosidi è uno dei composti farmacologicamente attivi del Ginseng, che potrebbe regolare molteplici vie metaboliche.10,11 Il ginsenoside Rg3 è il composto più attivo dei ginsenosidi.12 L'Rg3 esercita una varietà di proprietà farmacologiche tra cui antitumorale, antinfiammatorio, trattamento del diabete, effetti antipruriginosi.13-16 Inoltre, Rg3 potrebbe migliorare la funzione erettile nei ratti diabetici contro streptozotocina.17 Nel frattempo, Rg3 potrebbe migliorare le lesioni endometriali promuovendo l'apoptosi in cellule endometriali ectopiche.18 Tuttavia, l'effetto di Rg3 nelle cellule di leydig rimane poco chiaro.Il triptolide (TP), un triepossido diterpenico estratto da un'erba medicinale cinese Tripterygium wilfordii, è un agente contraccettivo maschile post-testicolare.19 Huang et al hanno dimostrato che il TP potrebbe produrre tossicità cellulare sul sistema riproduttivo maschile nei ratti aumentando il tasso di deformità di sperma.20 È stato riportato che la TP induce infertilità nei ratti maschi.21 Inoltre, la durata più lunga del trattamento con TP potrebbe influenzare la spermatogenesi.19La glicogeno sintasi chinasi-3β (GSK3β) è una serina-treonina chinasi, che coinvolge alcune vie di segnalazione cellulare.22 La segnalazione di GSK3β è stata implicata nelle malattie cardiache e nei tumori umani.23 Tuttavia, poco si sa sul ruolo di GSK3β nella spermiogenesi.Inoltre, è stato riportato che l'ipogonadismo maschile era associato ai microRNA (miRNA).24 Le prove hanno indicato che il microRNA-26a (miR-26a) svolge ruoli importanti nelle cellule tumorali e nelle cellule staminali neurali;tuttavia, la funzione di miR-26a durante l'ipogonadismo maschile rimane poco chiara.23,25 Sebbene studi precedenti abbiano riportato che Rg3 avesse molteplici funzioni farmacologiche, i meccanismi con cui Rg3 regola la proliferazione e l'apoptosi nelle cellule MLTC-1 contro TP rimangono poco chiari.Pertanto, questo studio mirava a studiare l'effetto protettivo di Rg3 contro la tossicità indotta da TP nelle cellule MLTC-1.La linea cellulare di topo Leydig MLTC-1 è stata ottenuta dall'American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA).Le cellule sono state coltivate in terreno RPMI-1640 con siero bovino fetale al 10% (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), penicillina (100 U/mL, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) e streptomicina (100 μg /mL, Sigma Aldrich) a 37°C con il 5% di CO2.Rg3 è stato acquistato da Sigma Aldrich.Le cellule MLTC-1 (4x105 cellule per pozzetto) sono state piastrate in piastre da 6 pozzetti per una notte a 37°C.Quindi, i mimici di miR-26a sono stati trasfettati in cellule per 24 ore a 37 ° C utilizzando il reagente Lipofectamine 2000 secondo le istruzioni del produttore.I mimic MiR-26a sono stati acquistati da GenePharma (Shanghai, Cina).L'inibitore GSK3β 1 è stato fornito da MedChemExpress (Monmouth Junction, NJ, USA).Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Sigma Aldrich) è stato utilizzato per valutare la vitalità cellulare secondo le specifiche.Le cellule MLTC-1 (5x103 cellule per pozzetto) sono state piastrate in piastre da 96 pozzetti per una notte a 37°C.Successivamente, le cellule sono state trattate con TP (0, 40, 80, 120, 160 o 200 nM) o Rg3 (0, 5, 10, 20, 40 o 80 μM) per 24 ore a 37°C.Inoltre, le cellule sono state trattate con TP (120 nM) e Rg3 (0, 5, 10, 20 o 40 μM) per 24 ore a 37°C.Dopo 2 ore di incubazione con soluzione CCK-8 (10 μL), è stato applicato un lettore di micropiastre (BioRad, Hercules, CA, USA) per rilevare l'assorbanza delle cellule a una lunghezza d'onda di 450 nm.Le cellule MLTC-1 (5x104 cellule per pozzetto) sono state piastrate in piastre da 24 pozzetti per una notte a 37°C.Le cellule sono state fissate in metanolo a temperatura ambiente per 10 minuti.Quindi, le cellule sono state permeabilizzate in Triton X-100 e lavate 3 volte con PBS.I campioni sono stati quindi incubati con anti-Ki67 (Abcam Cambridge, MA, USA), anti-DAPI (Abcam) per 1 ora.Successivamente, le cellule sono state successivamente trattate con IgG H&L anti-ribbit di capra (Abcam) per 1 ora a 37°C.Successivamente, le cellule colorate sono state osservate mediante microscopia confocale (Olympus CX23, Tokyo, Giappone).Uguali quantità di proteine ​​(40 μg per corsia) sono state separate dai gel SDS-PAGE.Quindi, le proteine ​​sono state trasferite su membrane PVDF (Thermo Fisher Scientific).Le membrane PVDF sono state bloccate con latte scremato al 5% e incubate con i corrispondenti anticorpi primari per una notte a 4°C.Anti-Bax (Abcam, 1:1000, ab32503), anti-Bcl-2 (Abcam, 1:1000, ab32124), anti-caspasi 3 (Abcam, 1:1000, ab2302), anti-Cyto c (Abcam, 1:1000, ab133504), anti-GSK3β (Abcam, 1:1000, ab32391), anti-caspasi 9 (Abcam, 1:1000, ab32539), anti-β-actina (Abcam, 1:1000, ab8227).Successivamente, le membrane sono state lavate quattro volte con TBST (5 minuti ciascuna) e incubate con anticorpi secondari per 50 minuti.Successivamente, il reagente ECL (GE Healthcare, Buckinghamshire, Regno Unito) è stato applicato per la visualizzazione.Per catturare le macchie è stato utilizzato il sistema di imaging ChemiDoc™XRS+ (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).Le cellule MLTC-1 sono state centrifugate e tripsinizzate a 4°C.Quindi, le cellule sono state lavate due volte con PBS pre-freddo e risospese in tampone legante (500 μL).5 μl di annessina V-FITC e 5 μl di reagenti PI sono stati aggiunti a ciascun campione per 10 minuti al buio.Il citometro a flusso Gallios (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) è stato applicato per analizzare le cellule apoptotiche utilizzando il software FlowJo (Ashland, OR, USA).L'RNA totale è stato estratto dalle cellule MLTC-1 secondo le specifiche del produttore utilizzando un kit Trizol (Thermo Fisher Scientific).Quindi, il kit di trascrizione inversa del cDNA (Thermo Fisher Scientific) è stato utilizzato per sintetizzare il cDNA.Successivamente, la PCR è stata eseguita utilizzando il kit SYBR Green master mix (Thermo Fisher Scientific).Le condizioni qPCR erano le seguenti: 94°C per 5 minuti;e 35 cicli di 95°C per 30 s, 60°C per 30 s e 75°C per 45 min.Le sequenze dei primer sono le seguenti: miR-34a: Forward: 5'-ACAGTCCTCATGCCAGGAAAGC-3', Reverse: 5'-GCACATTGATGATGCACAGGC-3';miR-15a: Attaccante: 5'-GCTAGCAGCACATAATGGTTTGTG-3', Rovescio: 5'-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3';miR-184: Avanti: 5'-TACGACTATGTGACCTGCCTG-3', Rovescio: 5'- TGGTTCAACTCTCCTTTCCA-3';miR-130a Avanti: 5'-GGGGTACCGCTTACCCACATCATA-3', Rovescio: 5'-GAAGATCTTACCACCATGGATCGTC-3';miR-26a: Attaccante: 5'- ACACTCCAGCTGGGTTCAAGTAATCCAGGA-3', Rovescio: 5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3';GSK3β: Attaccante: 5'-CAAAGCAGCTGGTCCGAGG-3', Rovescio: 5'-TCCACCAACTGATCCACACCAC-3', U6: Attaccante: 5'- CGCTTCGGCAGCACATATAC-3', Rovescio: 5'-AAATATGGAACGCTTCACGA-3'.I livelli relativi di miR-34a, miR-15a, miR-184, miR-130a, miR-26a e GSK3B sono stati normalizzati al livello di U6.Per analizzare i dati è stato utilizzato il metodo 2−ΔΔCt.26Le cellule MLTC-1 sono state piastrate su piastre da 96 pozzetti a 37°C e coltivate per raggiungere il 70% di confluenza.L'UTR umano di tipo selvaggio e di tipo mutante GSK3β-3' è stato costruito e clonato nel vettore pMIR-REPORT Luciferase (Promega, Madison, Wisconsin, USA).Il controllo mimic miR-26a progettato è stato quindi utilizzato per co-trasfettare le cellule MLTC-1 insieme ai plasmidi corrispondenti (tipo ampio GSK3β o mutante GSK3β) utilizzando Lipofectamine 2000 per 48 ore.L'attività del report della luciferasi è stata misurata con il Dual Luciferase reporter 1000 Assay System (Promega).I dati sono stati normalizzati all'attività della luciferasi della rellina del gruppo di controllo.Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti almeno tre esperimenti indipendenti e tutti i dati sono stati espressi come media ± DS.I dati sono stati condotti con GraphPad Prism versione 7 (GraphPad Software, CA, USA.).L'ANOVA unidirezionale seguita dal test di Dunnett è stata utilizzata per analizzare la differenza tra i gruppi con P<0,05 considerato come indicativo di una differenza statisticamente significativa (*P<0,05, **P<0,01).La struttura chimica di Rg3 è stata indicata nella Figura 1A.Il test CCK-8 è stato utilizzato per determinare gli effetti di Rg3 o TP sulla vitalità delle cellule MLTC-1.Come mostrato nella Figura 1B, TP ha inibito in modo dose-dipendente la proliferazione delle cellule MLTC-1.120 nM TP ha indotto circa il 60% di inibizione della crescita cellulare, che è stata utilizzata nei seguenti esperimenti.Inoltre, 80 μM Rg3 hanno inibito significativamente la proliferazione delle cellule MLTC-1, mentre 5, 10, 20 o 40 μM Rg3 non hanno avuto effetti inibitori evidenti sulle cellule MLTC-1 (Figura 1C).Inoltre, TP ha inibito la proliferazione delle cellule MLTC-1, che sono state invertite maggiormente dal trattamento di 20 μM Rg3 (Figura 1D).Pertanto, 20 μM di Rg3 sono stati utilizzati nei seguenti esperimenti.Allo stesso modo, i dati del test di immunofluorescenza hanno indicato che Rg3 ha mostrato effetti particolarmente protettivi contro la citotossicità indotta da TP (Figura 1E e F).Questi risultati hanno indicato che Rg3 potrebbe attenuare la citotossicità indotta da TP nelle cellule MLTC-1.Figura 1 Rg3 ha attenuato la citotossicità indotta da TP nelle cellule MLTC-1.(A) La struttura chimica di Rg3.(B) Il test CCK-8 è stato utilizzato per rilevare la vitalità delle cellule MLTC-1.Le cellule MLTC-1 sono state trattate con TP (0, 40, 80, 120, 160, 200 nM) per 24 ore.(C) Le cellule MLTC-1 sono state trattate con Rg3 (0, 5, 10, 20, 40, 80 μM) per 24 ore.(D) Le cellule MLTC-1 sono state trattate con TP (120 nM) e Rg3 (0, 5, 10, 20, 40 μM) per 24 ore.(E e F) Le cellule MLTC-1 sono state trattate con 120 nM TP o/e 20 μM Rg3 per 24 ore.I livelli di espressione della fluorescenza relativa sono stati quantificati mediante colorazione Ki67 e DAPI.**P<0,01 rispetto al gruppo di controllo;#P<0,05, ##P<0,01 rispetto al gruppo TP_120 nM;^^P<0,01 rispetto al gruppo TP_160 nM.Figura 1 Rg3 ha attenuato la citotossicità indotta da TP nelle cellule MLTC-1.(A) La struttura chimica di Rg3.(B) Il test CCK-8 è stato utilizzato per rilevare la vitalità delle cellule MLTC-1.Le cellule MLTC-1 sono state trattate con TP (0, 40, 80, 120, 160, 200 nM) per 24 ore.(C) Le cellule MLTC-1 sono state trattate con Rg3 (0, 5, 10, 20, 40, 80 μM) per 24 ore.(D) Le cellule MLTC-1 sono state trattate con TP (120 nM) e Rg3 (0, 5, 10, 20, 40 μM) per 24 ore.(E e F) Le cellule MLTC-1 sono state trattate con 120 nM TP o/e 20 μM Rg3 per 24 ore.I livelli di espressione della fluorescenza relativa sono stati quantificati mediante colorazione Ki67 e DAPI.**P<0,01 rispetto al gruppo di controllo;#P<0,05, ##P<0,01 rispetto al gruppo TP_120 nM;^^P<0,01 rispetto al gruppo TP_160 nM.Per studiare ulteriormente gli effetti di Rg3 nelle cellule MLTC-1 trattate con TP, è stata utilizzata la citometria a flusso.Come illustrato nelle Figure 2A e B, TP ha indotto marcatamente l'apoptosi delle cellule MLTC-1, che è stata invertita dal trattamento con Rg3.Inoltre, il western blotting è stato utilizzato per misurare le espressioni delle proteine ​​​​correlate all'apoptosi Bcl-2, Bax e caspasi attiva 3. Come indicato nella Figura 2C, D, E e F, TP ha aumentato i livelli di Bax e caspasi attiva 3 e ha aumentato il espressione di Bcl-2 nelle cellule, mentre questi effetti sono stati significativamente invertiti dal trattamento con Rg3.Questi dati hanno suggerito che Rg3 potrebbe invertire l'apoptosi indotta da TP delle cellule MLTC-1.Figura 2 Rg3 ha invertito l'apoptosi indotta da TP nelle cellule MLTC-1.Le cellule MLTC-1 sono state trattate con 120 nM TP o/e 20 μM Rg3 per 24 ore.(A e B) Le cellule apoptotiche sono state misurate con la doppia colorazione dell'Annessina V e PI.(C) I livelli di espressione di Bax, Bcl-2 e caspasi attiva 3 nelle cellule MLTC-1 sono stati rilevati con Western blotting.La β-actina è stata utilizzata come controllo interno.(D–F) Le espressioni relative di Bax, Bcl-2 e caspasi attiva 3 sono state quantificate tramite normalizzazione in β-actina.**P<0,01 rispetto al gruppo di controllo;##P<0,01 rispetto al gruppo TP_120 nM.Figura 2 Rg3 ha invertito l'apoptosi indotta da TP nelle cellule MLTC-1.Le cellule MLTC-1 sono state trattate con 120 nM TP o/e 20 μM Rg3 per 24 ore.(A e B) Le cellule apoptotiche sono state misurate con la doppia colorazione dell'Annessina V e PI.(C) I livelli di espressione di Bax, Bcl-2 e caspasi attiva 3 nelle cellule MLTC-1 sono stati rilevati con Western blotting.La β-actina è stata utilizzata come controllo interno.(D–F) Le espressioni relative di Bax, Bcl-2 e caspasi attiva 3 sono state quantificate tramite normalizzazione in β-actina.**P<0,01 rispetto al gruppo di controllo;##P<0,01 rispetto al gruppo TP_120 nM.La proliferazione delle cellule di Leydig potrebbe mantenere la spermatogenesi nei topi maschi adulti.27 Inoltre, la spermatogenesi si verifica principalmente nelle cellule di Leydig.27 Studi precedenti hanno dimostrato che miR-34a, miR-15a, miR-184, miR-130a e miR-26a hanno è stato dimostrato che è associato alla spermatogenesi.24,28–33 Pertanto, la qRT-PCR è stata utilizzata per rilevare i livelli di questi miRNA nelle cellule MLTC-1.Come dimostrato nella Figura 3A, il livello di miR-26a è stato significativamente sottoregolato da Rg3 nelle cellule MLTC-1.Tuttavia, l'espressione di miR-26a è stata leggermente sovraregolata nelle cellule MLTC-1 indotte da TP (Figura 3B).Figura 3 La sovraespressione di miR-26a ha invertito gli effetti protettivi di Rg3 contro la citotossicità indotta da TP nelle cellule MLTC-1.(A) Le cellule MLTC-1 sono state trattate con 20 μM di Rg3 per 24 ore.Espressioni relative di miR-34a, miR-15a, miR-184, miR-130a e miR-26a nelle cellule MLTC-1 sono state rilevate mediante qRT-PCR.(B) Le cellule MLTC-1 sono state trattate con 120 nM TP o/e 20 μM per 24 ore.L'espressione relativa di miR-26a nelle cellule MLTC-1 è stata rilevata mediante qRT-PCR.(C) Le cellule MLTC-1 sono state trasfettate con imitazioni di miR-26a 10 nM per 24 ore.L'espressione relativa di miR-26a nelle cellule MLTC-1 è stata rilevata mediante qRT-PCR.(D) Le cellule MLTC-1 sono state trattate con imitazioni di 10 nM miR-26a, 120 nM TP più 20 μM Rg3 o triplo trattamento per 24 ore.Il test CCK-8 è stato utilizzato per rilevare la vitalità delle cellule MLTC-1.(E e F) Le cellule MLTC-1 sono state trattate con imitazioni di 0 nM miR-26a, 120 nM TP più 20 μM Rg3 o triplo trattamento per 24 ore.Le cellule apoptotiche sono state misurate con la doppia colorazione dell'Annessina V e PI.**P<0,01 rispetto al gruppo di controllo;##P<0,01 rispetto al gruppo Rg3+ TP.Figura 3 La sovraespressione di miR-26a ha invertito gli effetti protettivi di Rg3 contro la citotossicità indotta da TP nelle cellule MLTC-1.(A) Le cellule MLTC-1 sono state trattate con 20 μM di Rg3 per 24 ore.Espressioni relative di miR-34a, miR-15a, miR-184, miR-130a e miR-26a nelle cellule MLTC-1 sono state rilevate mediante qRT-PCR.(B) Le cellule MLTC-1 sono state trattate con 120 nM TP o/e 20 μM per 24 ore.L'espressione relativa di miR-26a nelle cellule MLTC-1 è stata rilevata mediante qRT-PCR.(C) Le cellule MLTC-1 sono state trasfettate con imitazioni di miR-26a 10 nM per 24 ore.L'espressione relativa di miR-26a nelle cellule MLTC-1 è stata rilevata mediante qRT-PCR.(D) Le cellule MLTC-1 sono state trattate con imitazioni di 10 nM miR-26a, 120 nM TP più 20 μM Rg3 o triplo trattamento per 24 ore.Il test CCK-8 è stato utilizzato per rilevare la vitalità delle cellule MLTC-1.(E e F) Le cellule MLTC-1 sono state trattate con imitazioni di 0 nM miR-26a, 120 nM TP più 20 μM Rg3 o triplo trattamento per 24 ore.Le cellule apoptotiche sono state misurate con la doppia colorazione dell'Annessina V e PI.**P<0,01 rispetto al gruppo di controllo;##P<0,01 rispetto al gruppo Rg3+ TP.Come mostrato nella Figura 3C, il livello di miR-26a è stato notevolmente aumentato nel gruppo mimic miR-26a, rispetto al gruppo di controllo.Inoltre, gli effetti protettivi di Rg3 contro la citotossicità indotta da TP nelle cellule MLTC-1 sono stati invertiti dopo la trasfezione con imitazioni di miR-26a (Figura 3D).Inoltre, gli effetti protettivi di Rg3 contro l'apoptosi indotta da TP nelle cellule MLTC-1 sono stati invertiti anche da imitazioni di miR-26a (Figura 3E e F).Tutti questi risultati hanno indicato che la sovraespressione di miR-26a ha invertito gli effetti protettivi di Rg3 contro la citotossicità indotta da TP nelle cellule MLTC-1.È stato mostrato il meccanismo mediante il quale i miRNA mostrano effetti corrispondenti legandosi all'UTR 3' del gene bersaglio.34 Sono stati utilizzati tre strumenti bioinformatici online, TargetScan, miRDB o microRNA per prevedere i bersagli a valle di miR-26a.I risultati hanno mostrato che GSK3β era un potenziale bersaglio di miR-26a (Figura 4A e B).Inoltre, i dati del test della luciferasi hanno indicato che è stata osservata una ridotta attività della luciferasi nelle cellule MLTC-1 dopo la trasfezione con imitazioni psiCHECK-2-GSK3β-WT e miR-26a (Figura 4C).Inoltre, l'analisi qRT-PCR ha confermato che il livello di GSK3β è stato notevolmente ridotto dopo la trasfezione con imitazioni di miR-26a (Figura 4D).Questi dati hanno rivelato che GSK3β è un obiettivo a valle di miR-26a.La Figura 4 GSK3β era un bersaglio diretto di miR-26a.(A e B) La struttura genica di GSK3β nella posizione 1604–1611 indica il sito target previsto di miR-26a nel suo 3'UTR, con una sequenza di UUACUUGAC.(C) L'attività della luciferasi è stata misurata utilizzando il test del reporter della doppia luciferasi.(D) Le cellule MLTC-1 sono state trasfettate con imitazioni di miR-26a 10 nM per 24 ore.L'espressione relativa di GSK3β nelle cellule MLTC-1 è stata rilevata mediante qRT-PCR.**P<0,01 rispetto al gruppo di controllo.La Figura 4 GSK3β era un bersaglio diretto di miR-26a.(A e B) La struttura genica di GSK3β nella posizione 1604–1611 indica il sito target previsto di miR-26a nel suo 3'UTR, con una sequenza di UUACUUGAC.(C) L'attività della luciferasi è stata misurata utilizzando il test del reporter della doppia luciferasi.(D) Le cellule MLTC-1 sono state trasfettate con imitazioni di miR-26a 10 nM per 24 ore.L'espressione relativa di GSK3β nelle cellule MLTC-1 è stata rilevata mediante qRT-PCR.**P<0,01 rispetto al gruppo di controllo.Al fine di rilevare il meccanismo mediante il quale miR-26a regolava GSK3β nelle cellule MLTC-1, è stato applicato il Western blot.Come indicato nelle Figure 5A e B, il livello di GSK3β è stato significativamente aumentato dal trattamento con Rg3, mentre la sovraregolazione di GSK3β indotta da Rg3 è stata completamente inibita dall'inibitore selettivo di GSK3β.Inoltre, i dati di Western blotting hanno indicato che TP ha indotto notevolmente la sovraregolazione di Cyto c e la caspasi attiva 9 e in particolare la sottoregolazione di GSK3β, che sono state significativamente invertite da Rg3 (Figura 5C, D, E e F).Tuttavia, l'effetto protettivo di Rg3 è stato significativamente invertito dopo la trasfezione con imitazioni di miR-26a (Figura 5C, D, E e F).Questi risultati hanno suggerito che la sovraespressione di miR-26a potrebbe attenuare gli effetti protettivi di Rg3 contro la citotossicità indotta da TP mirando a GSK3β.Figura 5 La sovraespressione di miR-26a ha invertito gli effetti protettivi di Rg3 contro la citotossicità indotta da TP mirando a GSK3β.(A e B) Le cellule MLTC-1 sono state trattate con Rg3 (0, 10, 20 μM) o Rg3 (20 μM) più inibitore GSK3β 1 (20 nM) per 24 ore.Il livello di espressione di GSK3β nelle cellule MLTC-1 è stato rilevato con Western blotting.L'espressione relativa di GSK3β è stata quantificata tramite normalizzazione in β-actina.(C) Le cellule MLTC-1 sono state trattate con 120 nM TP +20 μM Rg3 o/e miR-26a imita per 24 ore.Espressioni di GSK3β e caspasi 9 attiva nelle cellule MLTC-1 e il livello di Cyto c nel citoplasma sono state rilevate con Western blotting.(D – F) Le espressioni relative di Cyto c, GSK3β e caspasi attiva 9 sono state quantificate tramite normalizzazione in β-actina.**P<0,01 rispetto al gruppo di controllo;##P<0,01 rispetto al gruppo Rg3+ TP.Figura 5 La sovraespressione di miR-26a ha invertito gli effetti protettivi di Rg3 contro la citotossicità indotta da TP mirando a GSK3β.(A e B) Le cellule MLTC-1 sono state trattate con Rg3 (0, 10, 20 μM) o Rg3 (20 μM) più inibitore GSK3β 1 (20 nM) per 24 ore.Il livello di espressione di GSK3β nelle cellule MLTC-1 è stato rilevato con Western blotting.L'espressione relativa di GSK3β è stata quantificata tramite normalizzazione in β-actina.(C) Le cellule MLTC-1 sono state trattate con 120 nM TP +20 μM Rg3 o/e miR-26a imita per 24 ore.Espressioni di GSK3β e caspasi 9 attiva nelle cellule MLTC-1 e il livello di Cyto c nel citoplasma sono state rilevate con Western blotting.(D – F) Le espressioni relative di Cyto c, GSK3β e caspasi attiva 9 sono state quantificate tramite normalizzazione in β-actina.**P<0,01 rispetto al gruppo di controllo;##P<0,01 rispetto al gruppo Rg3+ TP.Le cellule di Leydig svolgono ruoli importanti nella spermatogenesi, perché la sintesi di testosterone e spermatogenesi avviene principalmente nelle cellule di Leydig.35 Studi precedenti hanno scoperto che la TP potrebbe portare all'infertilità maschile.36 Inoltre, la TP potrebbe indurre tossicità riproduttiva influenzando la spermatogenesi e la spermiogenesi.37 In questo studio, abbiamo scoperto che TP ha inibito significativamente la proliferazione delle cellule MLTC-1.Tuttavia, l'effetto di tossicità del TP sulle cellule MLTC-1 è stato invertito da Rg3.Inoltre, Rg3 potrebbe invertire l'apoptosi indotta da TP nelle cellule MLTC-1 sottoregolando i livelli di Bax, caspasi 3 attiva, Cyto c e caspasi attiva 9 e sovraregolando il livello di Bcl-2.Kopalli et al hanno indicato che l'Rg3 potrebbe alleviare l'infertilità maschile mediata dall'ipertermia.38 Il ginseng potrebbe proteggere i fattori di fertilità e il danno testicolare nei ratti indotti da stress da immobilizzazione.39 Inoltre, il ginseng potrebbe migliorare la qualità degli spermatozoi inibendo l'apoptosi nei ratti.40 Coerentemente con questi studi, i nostri risultati hanno illustrato che Rg3 potrebbe attenuare la citotossicità indotta da TP nelle cellule MLTC-1.È stato dimostrato che un certo numero di miRNA sono stati considerati biomarcatori per la diagnosi dell'ipogonadismo maschile.41 I miRNA sono piccoli RNA endogeni, che svolgono ruoli importanti nell'ipogonadismo maschile e nell'infertilità.42 Ma et al hanno scoperto che miR-26a-5p potrebbe regolano l'apoptosi degli spermatozoi.33 Nel presente studio, il livello di miR-26a è significativamente sottoregolato nelle cellule MLTC-1 trattate con Rg3, mentre TP ha leggermente sovraregolato l'espressione di miR-26a nelle cellule MLTC-1.Questi risultati hanno indicato che il livello di miR-26a era regolato da Rg3 nelle cellule MLTC-1.Tuttavia, gli effetti protettivi di Rg3 contro la citotossicità indotta da TP nelle cellule MLTC-1 sono stati invertiti dopo la trasfezione con imitazioni di miR-26a.Pertanto, si può suggerire che miR-26a potrebbe invertire gli effetti anti-apoptotici di Rg3 sulle cellule MLTC-1.Presi insieme, i nostri dati hanno indicato che Rg3 protegge le cellule MLTC-1 contro TP mediante la downregulation di miR-26a.Tuttavia, non ci sono rapporti che indichino gli obiettivi cellulari di miR-26a sulle cellule MLTC-1.Il test del reporter della luciferasi è stato utilizzato per confermare gli obiettivi a valle di miR-26a.In questo studio, i dati hanno dimostrato che GSK3β era l'obiettivo diretto di miR-26a.GSK3β, una serina/treonina chinasi, è coinvolta in diversi processi cellulari tra cui la sintesi proteica, il ciclo cellulare, la proliferazione e l'apoptosi cellulare.42 Fei et al hanno indicato che il silenziamento di GSK3β potrebbe indurre l'apoptosi nelle cellule del cancro alla prostata.43 Hongjin et al hanno scoperto che l'adrenomedullina ha inibito l'apoptosi nelle cellule staminali mesenchimali tramite l'aumento di GSK3β.44 Inoltre, GSK3β fosforilato potrebbe inibire l'apoptosi mitocondriale-dipendente diminuendo il rilascio di cito-C citoplasmatico e caspasi 9.45 Questi rapporti hanno dimostrato che GSK3β potrebbe inibire l'apoptosi cellulare.46 Come previsto, in questo studio, 20 μM Rg3 ha aumentato significativamente il livello di GSK3β nelle cellule MLTC-1.Pertanto, abbiamo indicato che Rg3 attenuava la citotossicità indotta da TP nelle cellule MLTC-1 attraverso la sovraregolazione di GSK3β, che era coerente con studi precedenti.Inoltre, la sovraespressione di miR-26a ha sottoregolato il livello di GSK3β nelle cellule MLTC-1.Nel frattempo, miR-26a imita gli effetti protettivi di Rg3 contro la citotossicità indotta da TP inibendo il livello di GSK3β e aumentando il livello di Cyto c e caspasi 9 attiva. Questi risultati hanno illustrato che la sovraespressione di miR-26a ha invertito gli effetti protettivi di Rg3 contro la citotossicità indotta da TP mirando a GSK3β (Figura 6).In effetti, è possibile che Rg3 abbia esercitato un effetto protettivo contro TP regolando altri percorsi e sono necessarie ulteriori indagini in futuro.Figura 6 La sovraespressione di miR-26a ha invertito gli effetti protettivi di Rg3 contro la citotossicità indotta da TP.TP ha indotto significativamente l'apoptosi nelle cellule MLTC-1.Tuttavia, Rg3 ha invertito l'apoptosi indotta da TP nelle cellule MLTC-1.Inoltre, la sovraespressione di miR-26a ha invertito gli effetti protettivi di Rg3 contro la citotossicità indotta da TP mirando a GSK3β.Figura 6 La sovraespressione di miR-26a ha invertito gli effetti protettivi di Rg3 contro la citotossicità indotta da TP.TP ha indotto significativamente l'apoptosi nelle cellule MLTC-1.Tuttavia, Rg3 ha invertito l'apoptosi indotta da TP nelle cellule MLTC-1.Inoltre, la sovraespressione di miR-26a ha invertito gli effetti protettivi di Rg3 contro la citotossicità indotta da TP mirando a GSK3β.In questo studio, abbiamo scoperto che Rg3 mostrava effetti marcatamente protettivi contro l'apoptosi indotta da TP nelle cellule MLTC-1.Inoltre, la sovraespressione di miR-26a ha invertito gli effetti protettivi di Rg3 contro la citotossicità indotta da TP mirando a GSK3β.Questi risultati hanno indicato che Rg3 ha alleviato l'apoptosi indotta da TP nelle cellule MLTC-1 regolando GSK3β.Pertanto, Rg3 può fungere da potenziale agente per il trattamento dell'ipogonadismo maschile.Gli autori non segnalano conflitti di interesse in questo lavoro.1. 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